多組學(xué)的研究表明很多腸道微生物的基因與宿主生理功能密切相關(guān)，但是由于這些基因大多源于非模式的腸道細(xì)菌，例如厚壁菌門梭菌綱，因此揭示這些基因影響宿主的機(jī)制目前是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。與我們所熟知的具有成熟基因編輯方法的模式腸道細(xì)菌 (例如大腸桿菌和多形擬桿菌) 不同，這些非模式腸道細(xì)菌大多未進(jìn)行基因組測(cè)序，向其中引入含有基因編輯模塊的外源DNA的方法以及采用何種合適的基因編輯模塊都鮮有報(bào)道，這些原因使得在人體腸道中起主導(dǎo)作用的非模式腸道細(xì)菌的基因編輯手段十分欠缺。因此，發(fā)展體外、高效、標(biāo)準(zhǔn)化的方法向這些非模式腸道細(xì)菌中成功引入外源DNA，并且采用合適的基因編輯工具實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的編輯對(duì)于探索基因和宿主之間的關(guān)系而言至關(guān)重要。
2022年1月19日，來(lái)自美國(guó)康奈爾大學(xué)威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院 (Weill Cornell Medicine, Cornell University) 的郭春君研究組（第一作者為金文兵博士）在Cell上在線發(fā)表題為Genetic manipulation of gut microbes enables single-gene interrogation in a complex microbiome的研究論文，在這篇研究論文中，作者發(fā)展了一套開(kāi)發(fā)針對(duì)非模式腸道細(xì)菌的基因編輯工具的方法, 成功篩選了向88株腸道細(xì)菌 (以梭菌綱和擬桿菌綱為主) 中引入外源DNA的方法，建立合適的基因編輯手段對(duì)其中的目標(biāo)基因進(jìn)行編輯并在體外和無(wú)菌小鼠體內(nèi)兩方面進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜腸道菌群體系中對(duì)具有重要生理意義的初級(jí)膽汁酸7位脫羥基途徑中關(guān)鍵基因baiH影響宿主生理功能的機(jī)制的探索 (圖1) 。
圖1. 腸道細(xì)菌基因編輯工具的開(kāi)發(fā)幫助在復(fù)雜腸道菌群中探索目標(biāo)基因的功能
作者首先對(duì)200株實(shí)驗(yàn)菌株的固體/液體培養(yǎng)基進(jìn)行了篩選，并確定了適合種類/濃度的抗生素。對(duì)于梭菌綱菌株，作者在多個(gè)參數(shù)層面進(jìn)行優(yōu)化，包括增加候選origin of replication數(shù)量、優(yōu)化抗性基因的啟動(dòng)子、嘗試不同的接合轉(zhuǎn)移供體、不同的供體菌/受體菌比例、接合轉(zhuǎn)移時(shí)長(zhǎng)、嘗試不同引入質(zhì)粒的方法 (結(jié)合轉(zhuǎn)移和電轉(zhuǎn)化) 等等，最終以41%的成功率確定了38株梭菌綱菌株的質(zhì)粒引入方法。在此基礎(chǔ)上，在菌株基因組信息未知的情況下，作者分別采用CRISPRi-dCpf1和Group II intron兩種基因編輯的手段對(duì)所篩選出來(lái)可引入外源質(zhì)粒的菌株的基因編輯可行性進(jìn)行了驗(yàn)證。CRISPRi-dCpf1體系以所引入外源質(zhì)粒上的lacZα作為報(bào)告基因，通過(guò)驗(yàn)證該報(bào)告基因在菌株中表達(dá)的抑制來(lái)確認(rèn)菌株的可編輯性；Group II intron體系以菌株之間保守性很高的16S基因作為目標(biāo)基因，通過(guò)驗(yàn)證對(duì)16S基因的插入突變來(lái)確認(rèn)菌株的可編輯性。
對(duì)于擬桿菌綱菌株，由于其具有較高的同源重組效率，因此作者在多個(gè)參數(shù)條件優(yōu)化之后，采用自殺型質(zhì)粒，同樣在菌株基因組信息未知的情況下，以菌株之間保守性很高的16S基因作為目標(biāo)基因，通過(guò)驗(yàn)證對(duì)16S基因的單交換同源重組插入突變來(lái)同時(shí)確定菌株的外源質(zhì)粒引入方法和可編輯性。
隨后，在已知基因組信息的菌株中，作者對(duì)具體目標(biāo)基因進(jìn)行了編輯，實(shí)現(xiàn)了對(duì)bcat基因的表達(dá)的抑制，以及對(duì)丙酸、丁酸、異戊酸產(chǎn)生的敲除/抑制并進(jìn)行了無(wú)菌小鼠體內(nèi)驗(yàn)證。證明所開(kāi)發(fā)出來(lái)的基因編輯工具針對(duì)具體基因仍然可行。
基于此，作者發(fā)現(xiàn)所篩選出來(lái)可基因編輯的菌株中有一株未報(bào)道過(guò)的菌株具有使初級(jí)膽汁酸 (膽酸，鵝去氧膽酸) 發(fā)生7位脫羥基化產(chǎn)生次級(jí)膽汁酸 (脫氧膽酸，石膽酸) 的活性，通過(guò)基因組測(cè)序找到對(duì)應(yīng)的bai operon之后，敲除了7位脫羥基途徑中的關(guān)鍵基因baiH，突變株在體外和無(wú)菌小鼠體內(nèi)都喪失了7位脫羥基化的活性。
在此基礎(chǔ)上，作者將獲得的baiH敲除突變株定植于具有復(fù)雜菌群的SPF老鼠，發(fā)現(xiàn)baiH基因的敲除同樣使SPF老鼠的腸道喪失了7位脫羥基化的活性，并且會(huì)顯著影響小鼠腸道的膽汁酸分布以及菌群分布。在DSS結(jié)腸炎模型中，baiH敲除突變株定植的SPF老鼠相比于野生型菌株定植的SPF老鼠具有更好的抗炎癥表現(xiàn)。
通過(guò)進(jìn)一步研究，作者發(fā)現(xiàn)baiH敲除突變株相比野生型菌株定植的SPF老鼠具有更好抗炎癥表現(xiàn)。其中的原因之一可能是baiH敲除突變株定植的SPF老鼠相比于野生型菌株的腸道中具有促炎作用的細(xì)菌Erysipelotrichaceae的豐度顯著降低，并且根據(jù)所定植SPF老鼠腸道菌群16S測(cè)序結(jié)果構(gòu)建了一個(gè)含有Erysipelotrichaceae和野生型菌株/baiH敲除突變株的小型菌群在無(wú)菌小鼠里面對(duì)這一推測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證。
綜上所述，作者篩選了一系列腸道細(xì)菌引入外源DNA的方法，建立了合適的基因編輯手段對(duì)其中的目標(biāo)基因進(jìn)行編輯并進(jìn)行了體外和體內(nèi)驗(yàn)證，并且成功將該方法用于探索初級(jí)膽汁酸7位脫羥基途徑中關(guān)鍵基因baiH影響宿主生理功能的機(jī)制。該方法的建立將大大促進(jìn)人們對(duì)腸道菌群基因和宿主之間相互作用的研究。
聯(lián)系客服
