今天和大家分享的是2020年1月發(fā)表在Cancers Medicne（IF=3.491）上的一篇文章：“Identify potential clinical significance of long noncoding RNA forkhead box P4 antisense RNA 1 in patients with early stage pancreatic ductal adenocarcinoma”，作者在證明FOXP4-AS1的預后價值后，通過全基因組富集分析發(fā)現(xiàn)FOXP4-AS1與多個腫瘤相關(guān)通路有關(guān)，揭示了其在PDAC中的潛在分子機制；此外，兩種針對FOXP4-AS1的小分子靶向治療藥物的發(fā)現(xiàn)進一步豐富了其臨床價值。
Identify potential clinical significance of long noncoding RNA forkhead box P4 antisense RNA 1 in patients with early stage pancreatic ductal adenocarcinoma
PDAC（胰腺導管腺癌）是一種常見的胰腺癌類型，通常預后生存率較差。近來的許多研究表明FOXP4-AS1（一種lncRNA）與許多癌癥的疾病進展和預后有關(guān)，比如結(jié)直腸癌和前列腺癌。但FOXP4-AS1對早期PDAC的臨床意義（包括預后價值，分子機制，用于靶向治療的小分子藥物）尚未得到研究。
作者下載了TCGA中112例做過胰十二指腸切除術(shù)的PDAC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，使用R包“DESeq”進行歸一化處理，并在補表1中給出了患者隊列的臨床病理數(shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)其中組織學評分、放射治療、根治性切除、靶向治療四個因素與PDAC患者的預后有關(guān)，因此這四個預后因素被選作后面多因素cox回歸中的變量。
取FOXP4-AS1中位表達水平將TCGA患者隊列分為高/低表達組，圖1.A的散點圖和圖2.B的KM生存分析結(jié)果均反映了FOXP4-AS1的高表達與PDAC的不良預后有關(guān)。接著，作者繪制了ROC曲線，證明了FOXP4-AS1的表達水平有著良好的預后預測價值（1-4年的AUC值分別為：0.514、0.595、0.688、0.771）
同時，作者利用FOXP4-AS1表達水平和其他臨床預后因素共同作為變量，構(gòu)建了如圖2所示的列線圖。結(jié)果顯示FOXP4-AS1表達水平是僅次于TNM分期和靶向治療的重要預后影響因素。
圖1.對FOXP4-AS1在PDAC中的生存分析結(jié)果
圖2.整合FOXP4-AS1表達水平和其他臨床因素的列線圖
接著，為了探究將FOXP4-AS1表達水平與其他臨床因素整合后是否會提升對PDAC進行預后預測的準確性，作者將FOXP4-AS1表達水平與上述四個臨床因素分別兩兩組合，并將患者分別按照四種情況進一步分組后做KM生存分析（以FOXP4-AS1表達水平與放療組合為例：a組為低表達無放療，b組為低表達有放療，c組為高表達無放療，d組為高表達有放療）。結(jié)果如圖3所示，作者發(fā)現(xiàn)與臨床因素整合可以提高FOXP4-AS1的預后價值。在此基礎上，作者進一步用多因素cox回歸分析進行驗證（表1），得到了同樣的結(jié)論（除了與放療因素組合的情況）
表1.多因素cox回歸結(jié)果
為了研究FOXP4-AS1在PDAC中的潛在分子機制和相關(guān)通路，作者對FOXP4-AS1的共表達基因進行了富集分析。首先，作者對FOXP4-AS1進行全基因組的共表達分析，以pearson相關(guān)系數(shù)>2，p<0.05作為作為標準，共得到22個與FOXP4-AS1負相關(guān)的基因和905個與FOXP4-AS1正相關(guān)的基因，并在圖4中給出了這些基因與FOXP4-AS1的共表達網(wǎng)絡。接著，作者利用DAVID對這些FOXP4-AS1相關(guān)基因進行GO和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤疾病進展有關(guān)的通路和生物學過程在FOXP4-AS1相關(guān)基因中富集，具體富集通路結(jié)果如下：
GO：細胞粘附、局灶性粘附、三羧酸循環(huán)、DNA損傷反應、脂質(zhì)分解過程
KEGG：氧化磷酸化、胰腺分泌、過氧化物酶體、三羧酸循環(huán)
圖4.FOXP4-AS1的基因共表達網(wǎng)絡
接著作者分別利用GeneMANIA（圖5）和STRING（圖6）構(gòu)建了FOXP4-AS1相關(guān)基因的共表達網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)FOXP4-AS1相關(guān)基因之間具有復雜的共表達網(wǎng)絡。
圖6.STRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡
按FOXP4-AS1中位表達水平對患者隊列分組，利用R包“edgeR”篩選出676個DEGs。如圖7中的火山圖所示，其中有285個上調(diào)，391個下調(diào)基因。接著，作者利用DAVID對DEGs進行GO和KEGG分析，同樣發(fā)現(xiàn)多種與腫瘤疾病進展有關(guān)的通路和生物學過程在DEGs中富集，具體結(jié)果如下：
GO：細胞表面受體級聯(lián)反應、PI3K信號通路、細胞增殖、血管新生調(diào)控、JAK/STAT通路
KEGG：胰腺分泌、細胞粘附、細胞色素P450代謝、細胞因子-受體相互作用
圖7.DEGs火山圖
接著作者分別利用GeneMANIA（圖8）和STRING（圖9）構(gòu)建了DEGs的基因共表達網(wǎng)絡和PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)DEGs之間具有復雜的共表達網(wǎng)絡。
圖9.STRING構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡
最后，作者利用CMAP分析鑒定出兩種小分子靶向治療藥物（在CMAP分析中取中位connect score<-0.2的分子），分別是茶苯海明和甲氧基腎上腺素，它們的化學式和CMAP分析結(jié)果如圖10所示，二者具有作為FOXP4-AS1靶向治療藥物的潛在價值。
為了進一步研究FOXP4-AS1在PDAC中的作用機制，作者對FOXP4-AS1高低表達組樣本分別進行PDAC全基因組數(shù)據(jù)的GSEA基因富集分析。首先使用c5作為參考基因集，如圖11所示，細胞呼吸、電子傳遞鏈、氧化磷酸化、MAPK、非編碼RNA形成以及氧化還原酶作用在FOXP4-AS1高表達組中富集；接著，使用c2作為參考基因集，如圖12所示，F(xiàn)OXP4-AS1高表達與TCA循環(huán)電子傳遞鏈、氧化磷酸化、TP53磷酸化明顯有關(guān)（圖12.A-C）；而FOXP4-AS1低表達則與CD8-TCR、PI3K、NF-κB、AP-1、JAK/STAT、細胞因子-受體相互作用、NK細胞毒性以及TCR級聯(lián)反應有關(guān)（圖12.D-L）
小結(jié)
本篇文章中，作者證明了FOXP4-AS1的預后價值（FOXP4-AS1高表達與PDAC不良預后有關(guān)），并通過全基因組富集分析發(fā)現(xiàn)FOXP4-AS1與氧化磷酸化、TCA循環(huán)、腫瘤免疫、細胞粘附等多個腫瘤相關(guān)通路有關(guān)，揭示了FOXP4-AS1在PDAC中的潛在分子機制。同時，作者鑒定出兩種針對FOXP4-AS1的小分子靶向治療藥物，進一步豐富了其臨床價值。
文章局限性：1、本文使用的所有患者數(shù)據(jù)均來自同一個TCGA隊列，且樣本容量較小，因此需要更大的樣本隊列對研究結(jié)論進行驗證；2、從TCGA下載的數(shù)據(jù)中，有部分患者的臨床數(shù)據(jù)有缺失，可能造成結(jié)果的不準確；3、文章的分子機制研究全部基于富集分析等生物信息學手段，因此需要進行in vivo和in vitro的實驗對結(jié)論進行驗證。
