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|導(dǎo)讀：
憑借其無(wú)與倫比的發(fā)育潛能，萬(wàn)眾矚目的PSCs一直是主角，這一次，被超越了。
|背景介紹：
在所有已知類型的體外衍生干細(xì)胞中，多能干細(xì)胞(PSCs)被認(rèn)為具有最大的發(fā)育潛能，并能產(chǎn)生成年生物體的所有細(xì)胞類型。(Evans和Kaufman，1981年；Martin，1981年；Thomson等人，1998年)
具有不同分子標(biāo)記和功能性質(zhì)的PSCs分別被衍生出來(lái)后，人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到不同階段的多能性，例如naive和primed，可以在體外以不同的培養(yǎng)參數(shù)穩(wěn)定培養(yǎng)。(Brons等人，2007年；Nichols和Smith，2009年；Tesar等人，2007年；Wu等人，2015年)
與primed狀態(tài)的PSCs相比，naive狀態(tài)的PSCs可能具有更高的發(fā)育潛力，這分別在小鼠(Ying等人，2008年)、大鼠(Buehr等人，2008年；Li等人，2008年)、人類(Chan等人，2013年；Gafni等人，2013年；Guo等人，2016年；Takashima等人，2014年；Theunissen等人，2014年；Wang等人，2014年；Ware等人，2014年)和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物(Chen等人，2015年；Fang等人，2014年)身上得到了驗(yàn)證。
盡管PSCs具有豐富的可以發(fā)育成所有胚胎(Em)衍生物的發(fā)育潛能，但是卻不能發(fā)育成胚胎外( extraembryonic (ExEm) tissues)組織，特別是最終發(fā)育成胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞系。(Beddington和Robertson，1989年)
在植入前發(fā)育過(guò)程中，受精卵和卵裂子（卵裂球時(shí)期的細(xì)胞）都被認(rèn)為是全能的，因?yàn)樗鼈兛梢援a(chǎn)生所有的Em和ExEm細(xì)胞系。(Papaioannou等人，1989年；Tarkowski，1959年)
卵裂球發(fā)育成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)或外胚層(TE)后，胚胎細(xì)胞的發(fā)育潛能就開(kāi)始受到限制。隨后繼續(xù)的細(xì)胞分裂使胚胎發(fā)育為成熟囊胚中的三個(gè)細(xì)胞譜系——上胚層（epiblast)、原始內(nèi)胚層(primitive endoderm)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm, TE)——它們的發(fā)育潛能已通過(guò)胚胎干細(xì)胞的衍生技術(shù)在體外被捕獲(Evans和Kaufman，1981年；Martin，1981年)、胚外內(nèi)胚層細(xì)胞（Extra-embryonic endoderm，XEN)(Kunath等人，2005年)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm, TE)(Tanaka等人，1998年）。囊胚所有三個(gè)譜系都能在體外穩(wěn)定維持后便衍生了一個(gè)問(wèn)題：是否可以在體外穩(wěn)定一個(gè)具有能向Em和ExEm兩個(gè)譜系發(fā)育的細(xì)胞狀態(tài)？
胚外內(nèi)胚層：這里的“胚”指的是“胚胎“，而不是”囊胚“！
圖1. 胚胎早期發(fā)育
最近的研究已經(jīng)確定了體外培養(yǎng)的小鼠ES細(xì)胞中有可以同時(shí)分化為Em和ExEm譜系的細(xì)胞亞群。
(Macfarlan等人，2012年；Morgani等人，2013年)
有趣的是，體內(nèi)重新編程也產(chǎn)生了具有相似特征的短暫存在的細(xì)胞。
(Abad等人，2013年)
然而，這些細(xì)胞的特征在體外培養(yǎng)中不能穩(wěn)定地維持，而且也沒(méi)有嚴(yán)格地測(cè)試它們?cè)隗w內(nèi)的發(fā)育潛力。
因此，獲得和維持具有，與PSCs相比，更大發(fā)育潛能的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物干細(xì)胞系是否可行的問(wèn)題仍有待解決。
在這項(xiàng)研究中，通過(guò)化學(xué)物篩選，我們已經(jīng)確定了一種化學(xué)雞尾酒（即幾個(gè)化合物混雜在一起），賦予人類和小鼠PSCs能與胚胎和ExEM都有嵌合的能力。
這些細(xì)胞被指定為擴(kuò)展的多能干（extended pluripotent stem，EPS)細(xì)胞，可以從囊胚（中的ICM?)，從已知的PSCs轉(zhuǎn)化過(guò)來(lái)，也可以通過(guò)體細(xì)胞重編程產(chǎn)生。
EPS細(xì)胞可以在培養(yǎng)過(guò)程中長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持，同時(shí)能保持在單細(xì)胞水平上對(duì)Em和ExEm細(xì)胞系都有貢獻(xiàn)的能力。
|核心內(nèi)容：
在所有已知的體外培養(yǎng)的干細(xì)胞類型中，多能干細(xì)胞(PSCs)的發(fā)育潛能可以說(shuō)是”傲視群雄、鶴立雞群“，其特征是它們能夠誘導(dǎo)發(fā)育生成成年有機(jī)體的所有細(xì)胞類型。也就是我們說(shuō)的”類全能“或”亞全能“，因?yàn)槁蚜亚虬l(fā)育前的細(xì)胞才有全能性，包括受精卵、2C、4C、8C。
然而，PSCs在體內(nèi)對(duì)胚胎外胎盤組織（ExEm)的貢獻(xiàn)有限。
在這里，我們證明了一種化學(xué)混合物（LCDM）能夠從小鼠和人類中衍生出具有獨(dú)特功能和分子特征的干細(xì)胞，這些干細(xì)胞被指定為擴(kuò)展多能干細(xì)胞(EPS)細(xì)胞，或者叫超潛能干細(xì)胞，它們能夠同時(shí)嵌合胚胎和胚胎外組織(圖1&圖2）。
圖1. 一種支持hEPS細(xì)胞衍生的化學(xué)混合物的鑒定(A)用于篩選化合物的策略，不能轉(zhuǎn)化為naive狀態(tài)的細(xì)胞都會(huì)死亡，primed也不能存活。 (B-D)具有代表性的圖像顯示通過(guò)轉(zhuǎn)化primed狀態(tài)的hPSCs(B)、從人胚泡(C)中重新衍生或通過(guò)體細(xì)胞重編程(D)產(chǎn)生hEPS細(xì)胞。
圖2. LCDM條件可以支持mEPS細(xì)胞的產(chǎn)生，具有擴(kuò)展的發(fā)育潛能（A和B）從囊胚(A)中衍生出mEPS細(xì)胞，并通過(guò)轉(zhuǎn)換mES細(xì)胞(B)。Td: Tdtomato熒光信號(hào)。（C）具有代表性的圖像顯示mEPS衍生細(xì)胞(mc6-1，Tdtomato標(biāo)記，左面板)整合到胚胎、胎盤和卵黃囊中。常規(guī)的mES細(xì)胞(mc2i-1，tdtomato標(biāo)記，右面板)有助于胚胎和卵黃囊。在每個(gè)圖像中，右側(cè)的樣本是未注射mEPS或mES的空白對(duì)照小鼠孕體。標(biāo)尺：1毫米。（D）多細(xì)胞注射E12.5嵌合體分析。條形圖顯示了E12.5嵌合百分比(灰色，整合到胚胎組織[Em]；黑色，整合到胚胎和ExEM胎盤組織[Em&ExEM。n表示回收的E12.5小鼠孕體的數(shù)目。 （E）顯示在8C期胚胎中注入單個(gè)Tdtomato標(biāo)記的mEPS細(xì)胞的圖表，48~60小時(shí)后進(jìn)行分析。 右下角白色標(biāo)尺：20毫米。（F）8C胚胎期單細(xì)胞注射嵌合試驗(yàn)總結(jié)。條形圖顯示了回收的囊胚中嵌合體的百分比。ICM&TE: 將小鼠細(xì)胞整合到ICM和TE中的胚胎。n表示回收的囊胚數(shù)量。（G）具有代表性的圖像顯示具有ICM和TE標(biāo)記特異性抗體的單個(gè)mEPS衍生嵌合囊胚的免疫染色。Td：直接觀察tdtomato熒光信號(hào)。白色箭頭：Tdtomato/CDX2細(xì)胞（在上圖中）或Tdtomato/GATA3細(xì)胞（在下圖中）；黃色箭頭，Tdtomato/OCT4細(xì)胞（在上圖中）或Tdtomato/Nanog細(xì)胞（在下圖中）。標(biāo)尺: 20毫米。
值得注意的是，單個(gè)小鼠EPS細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)胚胎和胚胎外系都表現(xiàn)出廣泛的嵌合貢獻(xiàn)，并可以通過(guò)四倍體互補(bǔ)技術(shù)產(chǎn)生單個(gè)EPS細(xì)胞衍生小鼠（圖3&圖4）。
圖3. 從單mEPS細(xì)胞注射的嵌合囊胚中衍生的ES、TS細(xì)胞（A）圖中提取ES和TS細(xì)胞，顯示將單mEPS細(xì)胞注射到8C胚胎中，用于48~60小時(shí)后建立ES和TS細(xì)胞。具有代表性的圖像顯示ES(EPS-ES，右上角面板)和TS(EPS-TS，右下面板)細(xì)胞從相同的單個(gè)mEPS嵌合囊胚中衍生出來(lái)。標(biāo)尺：100毫米。（B）從相同的單mEPS嵌合胚胎中獲得的mEPS衍生出來(lái)的ES和TS細(xì)胞。
（C）顯示將多個(gè)mES細(xì)胞注入8C胚胎的圖表，用于在48-60小時(shí)后建立ES和TS細(xì)胞。具有代表性的圖像顯示從多個(gè)mES嵌合囊胚衍生出ES(2i-ES)，但不能衍生出TS細(xì)胞。標(biāo)尺：100毫米。（D）具有代表性的圖像顯示EPS-ES（見(jiàn)圖A)細(xì)胞可以整合到E13.5胚胎中,但不能衍生出胎盤。標(biāo)尺：1毫米。在較低的面板中，右側(cè)的胚胎來(lái)自一個(gè)未注入EPS-ES的空白對(duì)照。（E）具有代表性的圖像顯示EPS-TS（見(jiàn)圖A)細(xì)胞只能整合到E13.5小鼠孕體胎盤中。標(biāo)尺：1毫米。
圖4. 單mEPS可在體內(nèi)同時(shí)分化為胚胎和胚胎外組織
（A）對(duì)同一E10.5小鼠孕體的單mEPS細(xì)胞衍生的百分比進(jìn)行了FACS分析（流式）。NC：從未注射的E10.5小鼠孕體中分離出的樣本。 (Td：Tdtomato標(biāo)記)
（B-D）具有代表性的全胎盤共聚焦圖像顯示單個(gè)mEPS衍生細(xì)胞(Tdtomato標(biāo)記)可嵌合進(jìn)E10.5胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞譜系。單mES細(xì)胞作為對(duì)照注射。用抗CK8(B)、抗PROLIFERIN(C)和抗TPBPA(D)抗體對(duì)胎盤進(jìn)行染色。直接觀察Tdtomato熒光信號(hào)；dec，蛻膜層；gc，巨細(xì)胞層；sp，海綿滋養(yǎng)層；laby，迷宮層。 右上角嵌入的正方形方框是黃色正方形放大后的結(jié)果。標(biāo)尺:200毫米。
（E）具有代表性的圖像顯示單個(gè)mEPS衍生細(xì)胞(Tdtomato標(biāo)記)在E17.5假孕小鼠中對(duì)胚胎和胎盤的貢獻(xiàn)。左側(cè)和右側(cè)面板中顯示的單個(gè)mEPS嵌合胎盤的圖像取自同一胎盤樣本的不同側(cè)面（左側(cè)面板的是正面，右側(cè)面板——準(zhǔn)確說(shuō)是右側(cè)面板的右側(cè)樣品——的是背面）。對(duì)于中、右面板，每個(gè)圖像中左側(cè)的樣本來(lái)自一個(gè)未注入mEPS空白對(duì)照。標(biāo)尺：2.5毫米。 （F&G）具有代表性的圖像顯示單個(gè)mEPS衍生嵌合體(C1-EPS19#)(F)和單個(gè)mEPS細(xì)胞衍生小鼠的種系傳遞(G)。
（H）通過(guò)四倍體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)獲得單mEPS細(xì)胞衍生小鼠(C1-EPS12#)的代表性圖像。
此外，人EPS細(xì)胞在假孕小鼠中表現(xiàn)出種間嵌合能力（圖5&圖6）。
圖5. 單個(gè)人源EPS細(xì)胞可與小鼠ICM和TE實(shí)現(xiàn)種間嵌合形成嵌合囊胚（A&B）顯示單個(gè)熒光報(bào)告標(biāo)記的hEPS細(xì)胞被顯微注射到一只小鼠8C胚胎中，注入胚胎被培養(yǎng)48~60小時(shí)(A)。然后，將胚胎與抗 OCT4 和抗 CDX2 抗體(B)共免疫熒光染色。mClover：直接觀察mClover熒光信號(hào)；hN：hN（ human nuclei）免疫染色；488：熒光信號(hào)來(lái)自488通道。注射primed狀態(tài)的hPSCs作為對(duì)照。白色箭頭：mClover/CDX2雙陽(yáng)性細(xì)胞；黃色箭頭，mClover/OCT4雙陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：20毫米。（C）在小鼠8C胚胎階段注射單hEPS細(xì)胞的嵌合試驗(yàn)摘要。
圖6. 在E10.5小鼠孕體中，hEPS細(xì)胞的種間嵌合（A）E10.5注入的hEPS胚胎中近似截面平面的示意圖。綠色和紅色方框分別表示大腦和心臟區(qū)域的矢狀部分。（B）具有代表性的圖像顯示hEPS衍生細(xì)胞與小鼠E10.5胚胎的整合?？谷撕?hN)抗體與抗SOX2(上方面板：(A)中的綠色方框)和抗GATA4(下方面板：(A)中的紅色方框)抗體共染色。右上角嵌入的方框是黃色小方框的放大效果。標(biāo)尺：100毫米。（C）具有代表性的全胎盤共聚焦圖像顯示Tdtomato標(biāo)記的hEPS衍生物可以通過(guò)與抗Tdtomato和抗細(xì)胞角蛋白8( cytokeratin 8, CK8)抗體共染色整合到E10.5嵌合胎盤的滋養(yǎng)層。注射primed狀態(tài)hPSCs作為對(duì)照。標(biāo)尺：200毫米。右邊的面板是黃色方框的放大效果（標(biāo)尺：20毫米）。 dec, decidua layer(蛻膜層); gc：giant cell layer(巨細(xì)胞層); sp：spongiotrophoblast layer(海綿滋養(yǎng)層); laby：labyrinth layer(迷宮層)。
詭異的是，EPS的表達(dá)圖譜和胚胎發(fā)育的每一個(gè)時(shí)期相差都很大，似乎是自成一派（見(jiàn)圖7）。
圖7. 分析EPS細(xì)胞的分子特征以及DiM和MiH在維持EPS發(fā)育潛能中的作用
（A&B）EPS細(xì)胞和已知PSC類型的RNA-seq和微陣列數(shù)據(jù)PCA分析結(jié)果。(A)和(B)Log2表達(dá)值歸一化的標(biāo)準(zhǔn)分別為mES細(xì)胞和primed-hPSCs。對(duì)于(A)，用于分析的17243個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)分別來(lái)自：mEPS細(xì)胞（本研究）、mES細(xì)胞（每項(xiàng)研究都有）、2C樣細(xì)胞(Macfarlan等人, 2012年)、上胚層（epiblast)干細(xì)胞(Najm等人, 2011年）。對(duì)于(B)，用來(lái)分析的15,958個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)分別來(lái)自：hEPS細(xì)胞的數(shù)據(jù)（本研究），幼稚的hPSCs(Takashima等人，2014年；Chan等人，2013年；Gafni等人，2013年；和Theunissen等人，2014年），primed-hPSCs（每項(xiàng)研究都有）。圓圈：RNAseq數(shù)據(jù)；三角形：微陣列數(shù)據(jù)。
（C&D）熱圖顯示mEPS(C)、hEPS(D)細(xì)胞分別與mES(C)、primed-hPSCs(D)細(xì)胞中存在的EPS特異性基因表達(dá)譜進(jìn)行比較。用歐氏距離（完全連鎖)計(jì)算基因與樣本之間的相關(guān)性）。在每項(xiàng)研究中，Log2表達(dá)值的歸一化標(biāo)準(zhǔn)分別為mES細(xì)胞(C)或primed-hPSCs(D)。hESC：primed-hPSCs。為了比較EPS細(xì)胞與植入前胚胎細(xì)胞，還分析了唐等人的數(shù)據(jù)。（2011年）(C)和Yan等人。（2013）(D)
（E）分析以其他化合物或Parp1基因敲除替代DiM或MiH對(duì)mEPS細(xì)胞嵌合能力的影響。一次實(shí)驗(yàn)注射多個(gè)細(xì)胞。條形圖顯示了回收的囊胚中嵌合體的百分比。n表示回收的囊胚數(shù)量。ICM&TE: 各種培養(yǎng)條件衍生的鼠多能干細(xì)胞同時(shí)與小鼠細(xì)胞ICM和TE整合。
（F）代表性圖像顯示DIM、MiH或兩者都從LCDM條件中去掉后的hEPS菌落的形態(tài)。標(biāo)尺：100毫米。
（G）代表性圖像顯示DIM或MiH被相應(yīng)的化合物替代后第7代hEPS菌落形態(tài)。標(biāo)尺：100毫米。
（H）分析DiM或MiH替代對(duì)hEPS細(xì)胞嵌合能力的影響。一次實(shí)驗(yàn)注射多個(gè)細(xì)胞。條形圖顯示了回收的囊胚中嵌合體的百分比。n表示回收的囊胚數(shù)量。ICM&TE: 各種培養(yǎng)條件衍生的人多能干細(xì)胞同時(shí)與小鼠細(xì)胞ICM和TE整合。TH：tripelennamine HCL（三苯胺）; DES：desloratadine（地氯雷他定）; NAM：nicotinamide（煙酰胺）. PD：PD 0325901; SB：SB 203580; SP: SP 600125.
盡管EPS的表達(dá)圖譜很詭異，但它的發(fā)育多能性是毋庸置疑的。
總之，該研究邁出了在體外培養(yǎng)中捕獲具有胚胎外發(fā)育潛能的多能干細(xì)胞的第一步，為基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)開(kāi)辟了新的途徑。
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簡(jiǎn)版：
在特定的化學(xué)（LCDM)培養(yǎng)條件下，多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成超潛能干細(xì)胞（EPS）,它可以在單細(xì)胞水平上產(chǎn)生胚胎和胚胎外組織。
