科研 | Food & Function：金蕎麥花粉多糖可減輕抗生素引起的腸道菌群失調(diào)并改善腸道屏障...
編譯：逍遙君，編輯：小菌菌、江舜堯。
原創(chuàng)微文，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。
導(dǎo)讀
抗生素是臨床最常用的抗感染藥物，但也可破壞正常的腸道微生物，引起腸屏障功能障礙。為了闡明金蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench）花粉水溶性多糖（WFPP）對(duì)抗生素處理小鼠腸屏障完整性的影響和機(jī)制，將BALB/c小鼠暴露于廣譜抗生素（頭孢曲松NR）或不暴露于廣譜抗生素（對(duì)照），并每日經(jīng)口灌胃給予低、中、高劑量WFPP（分別為100 mg/kg、200 mg/kg和400mg/kg），連續(xù)3周。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受頭孢曲松治療的小鼠表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩、胸腺和脾臟等免疫器官萎縮、腸道通透性增加和腸屏障損傷的癥狀，經(jīng)不同劑量的WFFP干預(yù)后恢復(fù)。而且，WFPP的有益作用與腸道sIgA分泌增強(qiáng)和炎癥反應(yīng)減少密切相關(guān)。進(jìn)一步的16S rDNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，WFPP提高了微生物多樣性和豐富度，改變了群落結(jié)構(gòu)，因此，緩解了頭孢曲松引起的微生物群微生態(tài)失調(diào)。結(jié)果表明，WFPP可以通過(guò)增加腸道sIgA分泌和抑制炎癥，緩解抗生素引起的菌群微生態(tài)失調(diào)以改善腸道屏障完整性。
原名：A polysaccharide from Fagopyrum esculentum Moench bee pollen alleviates microbiota dysbiosis to improve intestinal barrier function in antibiotic-treated mice譯名：金蕎麥花粉多糖可減輕抗生素引起的小鼠腸道菌群失調(diào)，并改善腸道屏障功能通訊作者單位：南昌大學(xué)食品科技國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室本文對(duì)WFPP進(jìn)行提取和結(jié)構(gòu)表征，對(duì)頭孢曲松導(dǎo)致的腸道菌群失調(diào)小鼠補(bǔ)充WFPP進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)比較WFPP干預(yù)組與未干預(yù)組小鼠血清生化指標(biāo)、腸道通透性結(jié)腸組織、胸腺等免疫相關(guān)臟器、腸道sIgA和炎性細(xì)胞因子的變化，在表觀層面驗(yàn)證了WFPP的生物學(xué)功效，此外通過(guò)16S rDNA測(cè)序?qū)δc道菌群的結(jié)構(gòu)和變化進(jìn)行表征，并用代謝通路預(yù)測(cè)探究和建立了WFPP修復(fù)抗生素引起的腸道菌群失調(diào)及并發(fā)癥的生物學(xué)機(jī)制。1 WFPP的初步特性鑒定
WFPP中總碳水化合物、糖醛酸、蛋白質(zhì)和多酚的含量分別為60.69±0.43%、12.23±0.54%、1.44±0.23%和0.41±0.03%。WFPP的單糖GC色譜圖及其組成如圖1所示，WFPP主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，三種單糖的總含量可達(dá)92.52%，含有少量的鼠李糖、木糖和甘露糖。WFPP中鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的質(zhì)量比為2.84：34.57：1.69：1.12：27.11：30.84。圖1 WFPP單糖結(jié)構(gòu)。（A）GC色譜圖。（B）單糖組成。
2 WFPP對(duì)生長(zhǎng)及血清生化指標(biāo)的影響如表1所示，與C組相比，NR組的最終體重、體重增加和攝食量較低。然而，WFPP經(jīng)口干預(yù)后，C組和3個(gè)WFPP組的最終體重和體重增加無(wú)顯著差異。與NR組相比，3個(gè)WFPP組的攝食量略有增加，但與C組相比仍明顯減少。這些結(jié)果表明，抗生素可能損害動(dòng)物生長(zhǎng)，WFPP干預(yù)可使其恢復(fù)。此外，與C組相比，3個(gè)WFPP組的WFPPL中TC和TG含量明顯降低。而各組其他血清生化指標(biāo)均無(wú)明顯變化。表1 WFPP對(duì)生長(zhǎng)、血清生化指標(biāo)、腸道通透性、免疫功能的影響。
3 WFPP對(duì)腸道通透性及免疫相關(guān)臟器的影響測(cè)定血清中LPS和腸黏膜MUC2的含量，探討WFPP對(duì)CEF處理小鼠腸道屏障功能的有益作用。如表1所示，MUC2表達(dá)不受CEF處理或WFPP干預(yù)的影響。與C組相比，NR組LPS含量顯著升高，但C組與WFPPM組或WFPPH組無(wú)明顯差異。結(jié)果表明，補(bǔ)充中或高劑量的WFPP可降低CEF處理小鼠血內(nèi)毒素水平，從而改善腸屏障功能。NR組胸腺和脾臟指標(biāo)最低，均較C組急劇降低，表明CEF治療后胸腺和脾臟萎縮。與NR組比較，不同劑量WFPP灌胃使胸腺、脾臟指標(biāo)急劇增強(qiáng)，恢復(fù)到C組水平。結(jié)果表明，WFPP能修復(fù)CEF對(duì)小鼠免疫器官的損傷，恢復(fù)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育。4 WFPP對(duì)CEF誘導(dǎo)的結(jié)腸組織學(xué)變化的影響通過(guò)H&E和AB-PAS染色獲得結(jié)腸組織切片，進(jìn)一步研究WFPP對(duì)CEF處理小鼠腸道屏障完整性的有益功能。如圖2A所示，C組結(jié)腸上皮細(xì)胞排列緊密有序，有大量結(jié)構(gòu)良好的隱窩，絨毛長(zhǎng)而清晰。而CEF組結(jié)腸黏膜潰瘍；隱窩結(jié)構(gòu)受損；上黏膜變形；炎性細(xì)胞嚴(yán)重浸潤(rùn)；絨毛變短、不規(guī)則；上皮屏障變形。NR組和WFPPL組腸黏膜潰瘍和隱窩破壞均有一定程度的減輕；黏膜與黏膜下層間隙明顯縮??；細(xì)胞炎性浸潤(rùn)仍存在但有改善。WFPPM組和WFPPH組結(jié)腸黏膜趨于正常；細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列有序；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)基本消失；隱窩結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常；絨毛長(zhǎng)度與C組相似。通過(guò)定量結(jié)腸絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和絨毛/隱窩比證實(shí)了這些觀察結(jié)果，如圖2B所示。此外，通過(guò)顯微鏡觀察了結(jié)腸組織切片中腸杯狀細(xì)胞和粘液的表達(dá)，結(jié)果如圖2 C所示。CEF組杯狀細(xì)胞和黏液面積較C組過(guò)度減少。WFPPM組和WFPPH組的杯狀細(xì)胞和粘液面積顯著升高，恢復(fù)到C組的水平。提示W(wǎng)FPP干預(yù)對(duì)CEF引起的損傷腸黏膜有良好的修復(fù)作用。圖2 WFPP對(duì)CEF誘導(dǎo)的結(jié)腸組織學(xué)變化的影響。（A）HE染色進(jìn)行腸組織學(xué)評(píng)價(jià)。（B）絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和絨毛/隱窩比。（C）AB-PAS染色進(jìn)行腸組織學(xué)評(píng)價(jià)。放大倍率，×200。
5 WFPP對(duì)腸道sIgA和炎性細(xì)胞因子的影響檢測(cè)腸道sIgA的含量，明確WFPP改善CEF治療小鼠腸道屏障功能的機(jī)制。如圖3所示，CEF處理顯著降低了腸道sIgA含量，通過(guò)不同劑量的WFPP干預(yù)，均恢復(fù)至C組。停止CEF治療后，NR組sIgA分泌升高，3個(gè)WFPP組的sIgA含量與NR組相比在數(shù)值上增強(qiáng)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。炎癥會(huì)損害腸道屏障功能，因此比較了WFPP對(duì)CEF處理小鼠腸粘膜中主要炎癥因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）分泌的影響（圖4）。給予CEF（CEF和NR組）可顯著增強(qiáng)腸道IL-6和IL-1β表達(dá)，通過(guò)低、中、高劑量WFPP干預(yù)均可恢復(fù)到C組水平。各組TNF-α濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，WFPP可誘導(dǎo)sIgA分泌，減少細(xì)胞因子（IL-6和IL-1β），有助于減輕CEF引起的腸道屏障損傷。圖4 腸粘膜中TNF-α（A）、IL-6（B）和IL-1β（C）的濃度。
從盲腸樣本中共獲得2916196個(gè)16SrDNA序列，平均每只小鼠97210個(gè)序列。根據(jù)97%以上的相似性定義了293個(gè)OTU。如圖5A所示，CEF組的OTU數(shù)量?jī)H為31，與C組相比顯著減少（221）。停止抗生素治療后，NR組OTUs數(shù)（146）增加，但仍明顯低于C組。WFPP干預(yù)后，WFPP組OTUs數(shù)明顯增加，即WFPPL組、WFPPM組和WFPPH組分別為139個(gè)、177個(gè)和205個(gè)OTU，其中WFPPH OTUs數(shù)基本恢復(fù)至C組。通過(guò)QIIME分析腸道菌群的β-多樣性，比較不同樣本在物種多樣性上的相似性（圖5B-5D）。PCoA、PCA和NMDS分析顯示，C、NR和WFP組大部分樣本與CEF組分離，WFPH組與C組有明顯的相似性。通過(guò)對(duì)OTU水平的Heatmap和UPGMA的分析，揭示了6組微生物群落的異同（圖5E和5F）。熱圖和UPGMA分析顯示個(gè)體間存在高度差異?？偟膩?lái)說(shuō)，WFPPM和WFPPH組與C組組裝在一起，而WFPPL和NR組聚集在CEF組中。圖5 微生物群落組成特征。（A）OTU直方圖。（B）基于未加權(quán)UniFrac距離的非度量維標(biāo)度（NMDS）。（C）主坐標(biāo)分析（PCoA）。（D）主成分分析（PCA）圖。（E）OUT水平的熱圖。（F）UPGMA分析。
根據(jù)表2，CEF組Chao1、Ace和Shannon指標(biāo)較C組顯著降低，表明灌胃CEF可顯著降低腸道菌群的多樣性和豐富度，破壞腸道菌群平衡，導(dǎo)致腸道菌群微生態(tài)失調(diào)。自然恢復(fù)一段時(shí)間后，NR組腸道菌群多樣性和豐富度增加，但仍顯著低于C組。WFPP干預(yù)以劑量依賴的方式顯著提高了腸道菌群的豐度和多樣性。更重要的是，WFPPH組的恢復(fù)效果強(qiáng)于其他兩個(gè)WFPP組，其中WFPPL組的指標(biāo)與NR組相似，WFPPH組與C組相似。
8 WFPP調(diào)節(jié)腸道微生物組的特定系統(tǒng)發(fā)育型進(jìn)一步進(jìn)行LEfSe分析，鑒定不同組腸道菌群有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物。線判別分析（LDA）評(píng)分分布直方圖和Cladograms如圖6D和6E所示。所有組中共有85例OTU存在顯著差異。C組有29個(gè)OTUs；CEF組有9個(gè)OUTs差異顯著；NR組有10個(gè)OUTs；WFPPL、WFPPM和WFPPH組分別有11、4和7個(gè)OUT。WFPPL中的擬桿菌目及其門、綱、屬、種豐富，差異顯著。f_Muribaculaceae及其屬和種在WFPPM中表現(xiàn)出明顯的差異，但o_Bacillales、f_Staphylococcaceae及其屬在WFPPH中存在顯著差異。如圖7所示，與C組相比，CEF組和WFPPM組有39條代謝途徑發(fā)生了顯著變化。此外，KEGG分析強(qiáng)調(diào)了C組和CEF組之間的顯著改變，其中cell motility, global and overview maps以及核苷酸代謝明顯減少，而復(fù)制和修復(fù)、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和氨基酸代謝增強(qiáng)。WFPP干預(yù)后，腸道菌群的大部分功能能力已恢復(fù)到C組的標(biāo)準(zhǔn)。因此，WFPP干預(yù)有利于腸道菌群代謝功能的差異。圖7 PICRUSt預(yù)測(cè)的腸道微生物群落功能。分別為C和CEF（A）、C和WFPPM（B）以及CEF和WFPPM（C）相關(guān)的微生物群落的推斷功能差異。C，對(duì)照；CEF，頭孢曲松；WFPPM，200 mg/kg WFPP。
金蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench）蜂花粉多糖因其潛在的健康促進(jìn)作用而受到廣泛關(guān)注。正常腸道黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障四部分組成，其中機(jī)械屏障是最重要的組成部分。
本研究發(fā)現(xiàn)CEF可使結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞；絨毛長(zhǎng)度縮短；杯狀細(xì)胞和黏液面積明顯減少。還可引起腸道通透性增加，細(xì)菌內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)血清LPS濃度升高。CEF引起的這些損傷被WFPP干預(yù)逆轉(zhuǎn)，表明WFPP可以改善腸道屏障完整性。sIgA是一種非炎性抗體，主要用于粘附大分子的病毒、細(xì)菌、抗原和有害物質(zhì)，表現(xiàn)出腸道屏障功能的保護(hù)作用。給予高劑量WFPP可以大幅增加腸道sIgA的分泌。同時(shí)，WFPP處理后變形菌門的相對(duì)豐度明顯增加。提示W(wǎng)FPP可通過(guò)上調(diào)變形菌門等一些特殊腸道菌群的豐度刺激sIgA分泌。CEF處理小鼠的血清LPS以及腸道IL-6和IL-1β水平顯著升高。同時(shí)，與C組相比，CEF組腸球菌的豐度顯著增加。WFPP干預(yù)后，IL-6、IL-1β、LPS、腸球菌的水平恢復(fù)到正常水平，提示W(wǎng)FPP可以通過(guò)下調(diào)腸球菌等一些特殊腸道菌群的豐度來(lái)抑制腸道炎癥。本研究驗(yàn)證了WFPP可以促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制有害菌有效緩解腸道菌群微生態(tài)失調(diào)，從而改善抗生素處理小鼠的腸道屏障功能。
2019年度回顧 | 微生態(tài)環(huán)境微生物類微文大合輯
2019年度回顧 | 微生態(tài)人體/動(dòng)物微生物類微文大合輯
2019年度回顧 | 技術(shù)貼合輯大放送
微生態(tài)科研學(xué)術(shù)群期待與您交流更多微生態(tài)科研問(wèn)題
（聯(lián)系微生態(tài)老師即可申請(qǐng)入群）。
本站僅提供存儲(chǔ)服務(wù)，所有內(nèi)容均由用戶發(fā)布，如發(fā)現(xiàn)有害或侵權(quán)內(nèi)容，請(qǐng)
點(diǎn)擊舉報(bào)。
