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2022年8月22日，德國海德堡大學Daniela Mauceri在《Cells》雜志發(fā)表了“Role of Epigenetic Mechanisms in Chronic Pain”的綜述文章，討論了DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等表觀遺傳機制對慢性疼痛的影響。
期刊：Cells
日期：2022.08.22
IF：7.666 /Q2
摘要
疼痛對人的生活感覺影響非常大，通常由組織損傷引起。在損傷處理后疼痛持續(xù)長時間時，即變成病理性疼痛。導致急性疼痛向慢性疼痛轉變的確切分子和細胞機制尚不清楚。慢性疼痛與疼痛有關的神經通路發(fā)生一些可塑性事件。這些持久的適應性變化通過改變相關基因表達來實現。在神經系統適應過程中基因轉錄的不同調節(jié)因子中，表觀遺傳機制起著重要作用。本綜述首先概述了表觀遺傳過程及其調控的主要類別，然后重點介紹表觀遺傳研究在不同形式慢性疼痛中的關鍵發(fā)現和未解決的問題。
表觀遺傳機制
表觀遺傳機制在不直接影響遺傳密碼的情況下調控基因表達。幾年前，神經表觀遺傳學這一術語被引入，適應神經系統中的表觀遺傳學機制與它們在印記、遺傳性或細胞命運決定中的作用可能截然不同。研究最多的是包括DNA甲基化和組蛋白翻譯后修飾（PTM）在內調節(jié)染色質狀態(tài)的表觀遺傳學機制。所有表觀遺傳標記的總和構成了表觀基因組，并在DNA縮合中起著關鍵作用。
（1）DNA甲基化
甲基（CH3）基團與DNA的共價加成發(fā)生在甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的嘧啶環(huán)5′碳位胞嘧啶上。受影響的胞嘧啶主要位于CpG島，至少200bp的DNA區(qū)域位于基因啟動子周圍。
DNA甲基化由DNA甲基轉移酶（DNMT）引起。哺乳動物中存在幾種DNMT，并根據其首選的DNA底物和甲基化模式分類。De novo DNMT、DNMT3a和DNMT3b在未甲基化的CpG位點上添加了新的甲基化標記，與DNMT1類似的維持性DNMT負責維持已經建立的甲基化標記（圖1A）。如果一條DNA鏈上的胞嘧啶被甲基化，將觸發(fā)DNMT1使用半甲基化DNA作為底物，使反鏈上的相應胞嘧啶甲基化。細胞可確保在DNA損傷或細胞分裂的情況下甲基化標記的自我維持。DNMT1有三種常見亞型（DNMT1s、DNMT1o、DNMT1 p），De novo DNMTs也有多種亞型（DNMT3a1、DNMT3a2、DNMT3b1），在DNMT3a條件下，變體源自位于DNMT3a基因座的內含子啟動子。除三個常見的DNMT外，另有兩個非典型家族成員DNMT2、DNMT3L不具有DNMT催化活性。DNMT2主要作為tRNA甲基轉移酶，而DNMT3L增加了DNMT3A和DNMT3B的催化活性。在結構水平上，DNMT通常具有N-末端調節(jié)域，隨后是位于C-末端的催化域。此外，它們具有與染色質、DNA和其他參與基因轉錄調控的蛋白互作結構域。
圖1：DNA甲基化
DNA甲基化和去甲基化受多種酶調控。
DNA甲基化酶的表達水平可以改變特定基因啟動子的甲基化狀態(tài)。DNMT表達增加促進高甲基化，DNMT表達降低與低甲基化相關。介導去甲基化的TET蛋白減少將促進高甲基化，TET蛋白增加導致低甲基化。
鑒于甲基化共價穩(wěn)定性，DNA甲基化此前被認為永久性不變。然而DNA去甲基化可以以被動或主動形式發(fā)生。在細胞分裂過程沒有維持DNA甲基化的情況下， DNA被動去甲基化。神經元有絲分裂后，細胞DNA去甲基化活化。一些研究證據表明，DNA去甲基化在神經系統中是一個動態(tài)過程，在與神經元DNA去甲基化有關的表觀遺傳erasers中，生長停滯和DNA損傷誘導（GADD）了45蛋白（GADD45A和GADD45B）和Tet家族（圖1A,B）。DNA去甲基化酶在神經系統的適應和不適應過程中發(fā)揮重要作用。
甲基化DNA主要通過兩種機制調控基因表達：甲基胞嘧啶由于空間位阻而抑制轉錄因子的結合，或被具有甲基結合域（MBD）的蛋白識別，進而招募具有染色質重塑能力的蛋白、轉錄因子或轉錄抑制因子。DNA甲基化表觀遺傳標記的最佳研究和表征readers——甲基CpG結合蛋白-2（MeCP2），在發(fā)育和成長期均參與多種神經元功能調節(jié)。此前研究表明DNA甲基化與緊密染色質和轉錄抑制有關，胞嘧啶甲基化可導致轉錄因子與其結合位點分離，并促進甲基CpG結合蛋白（MBPs）結合，MBPs可招募共抑制復合體。但最近研究表明根據基因組位置，DNA甲基化也可導致基因表達誘導，DNA甲基化不一定等于轉錄抑制，越來越多證據支持DNA甲基化可能使基因組允許對外部刺激誘發(fā)反應。
（2）組蛋白修飾
組蛋白在其突出的N-尾上經歷過多的PTM（圖2A）可逆修飾，其狀態(tài)由具有拮抗功能的酶調控，這些酶將添加（writers）或敲除（erasers）修飾。PTM影響組蛋白與DNA和其他蛋白互作，從而促進或抑制轉錄。甲基化和乙?；墙M蛋白最常見的PTM。
圖2：組蛋白翻譯后修飾和染色質狀態(tài)。
組蛋白可以經歷多種 PTM，如甲基化、乙?；⒎核鼗土姿峄?。
組蛋白乙?；腿ヒ阴；g的平衡影響染色質的結構，并受HAT和HDAC調控。
組蛋白上的賴氨酸和精氨酸殘基可以在多價狀態(tài)下甲基化。精氨酸可以是一個或兩個甲基，而賴氨酸殘基可以是單甲基化，二甲基化或三甲基化。不同的甲基化水平和模式通過增加或降低DNA-組蛋白互作改變染色質結構，從而導致基因轉錄的激活或抑制。最具特征的組蛋白甲基化標記是賴氨酸4上的組蛋白3（H3K4），主要在活性轉錄基因的轉錄起始位點富集。當三甲基化時，該位點促進染色質松動并促進轉錄因子招募，而H3K27是基因表達抑制的標志。根據底物殘基分類，甲基轉移酶家族包括精氨酸和賴氨酸甲基轉移酶，組蛋白甲基化長期以來和DNA甲基化一樣被認為是一種永久的表觀遺傳標記。但最新證據表明，組蛋白去甲基化是一個非常動態(tài)和精細調節(jié)的過程。從底物和反應機制來看，去甲基化酶分為兩大家族：賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶（LSD）和Jumonji-C（JMJC）去甲基化酶，
其中LSD1是第一個被鑒定的去甲基化酶。
除甲基化之外，組蛋白上的賴氨酸殘基也可乙?；⒁阴；砑拥綆д姷馁嚢彼釟埢?，會導致組蛋白與帶負電的DNA靜電親和性降低，使染色質結構向松弛方向移動，從而促進轉錄（圖2B）。乙?；那贸ǔＥc染色質的緊密狀態(tài)和轉錄抑制相關。乙?；ㄟ^組蛋白乙酰轉移酶（HAT）轉移，如p300/CBP（CREB（cAMP反應元件結合）結合蛋白），其中，乙酰CoA作為輔因子（圖2B）。HAT不僅作用于組蛋白，還作用于一系列蛋白，包括非核蛋白，被稱為K-乙酰轉移酶（KAT）。KAT數量眾多，根據其亞細胞定位和結構分為亞組，乙?；瘶擞浀膃rasers是組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases ,HDAC；圖2B）。
HDAC是一個由18種蛋白組成的家族，根據其結構域和輔因子的作用分為兩大類：鋅依賴性HDAC（包括HDAC I、II、IV類）和III類NAD依賴性sirtuins（SIRT 1-7）。HDAC I類包含HDAC1、2、3、8，HDAC II類分為IIa（HDAC4、5、7、9）和IIb（HDAC6、10）；HDAC IV類的唯一成員是HDAC11（圖3A）。II a類家族成員表現出影響其活性的特定行為，可以以信號依賴的方式在細胞核和細胞質之間穿梭。在錐體神經元中，II a類HDAC的亞細胞穿梭受突觸活性和核鈣調控（圖3B）。在中樞神經系統中，HAT和HDAC活性之間的平衡誘導或抑制基因轉錄，調控發(fā)育過程，并在衰老和神經退行性疾病以及適應過程中發(fā)揮作用。組蛋白上乙?；嚢彼醨eaders包含特定結構域，如溴結構域（bromodomain,BRD）、雙植物同源結構域（double plant homeodomain ,PHD）fingers和Yeats結構域。
圖3：組蛋白去乙?；福℉DAC）
組蛋白去乙?；负蛃irtuins分類。不同蛋白的主要結構域。
突觸活性調節(jié)神經元II a類HDAC出核。最終調節(jié)HDAC活性，對基因轉錄有重要影響。
（3）非編碼RNA（Noncoding RNA,ncRNA）
非編碼（nc）元件占人類基因組的大部分，nc元件可以對包括生理功能在內的功能發(fā)揮調控作用。根據長度ncRNA分為兩類：短ncRNA（小于200bp）和長ncRNA（大于200bp,lncRNA）。短ncRNA包括miRNA（microRNA）、siRNA（small interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）、snRNA/snoRNA（small nuclear and nucleolar RNA）、tiRNA（transcription initiation RNA），rRNA（ribosomal RNA）和piRNA（piwi-interacting RNA）。LncRNA包括ncRNA擴增重復序列（expansion repeats）、天然反義轉錄本（natural antisense transcripts）和增強子RNA基因間ncRNA（enhancer RNA intergenic ncRNA）。
短ncRNA類研究較多的是單鏈、長19-22bp的miRNA，可以通過觸發(fā)特定mRNA的降解來抑制基因表達。miRNA可靶向一個或多個mRNA，且可調節(jié)高達60%的編碼基因。在神經系統中，miRNA表達方式取決于大腦區(qū)域以及發(fā)育階段。miRNA是結構和功能可塑性等不同適應過程中的關鍵調節(jié)因子。
lncRNAs與mRNA一樣，由RNA聚合酶II產生后進行加工，其二級結構定義了與基因組DNA或蛋白互作。lncRNA是基因表達的重要調節(jié)因子，包括染色質修飾、印跡、RNA剪接、與轉錄因子互作、翻譯調控和核轉運。
慢性疼痛的表觀遺傳機制
基因表達誘導或抑制維持慢性疼痛的不適應性變化，在疼痛處理的所有主要解剖區(qū)域中發(fā)現的變化通常受表觀遺傳調控（圖4），其中負責檢測傷害性刺激（如熱、冷、壓力或酸）的第一個部位是外周感覺神經元，雙極神經元在背根神經節(jié)（DRG）的體細胞，軸突末端位于外周，可將傷害性輸入傳遞到中樞神經系統（CNS）的脊髓。感覺神經元的過度興奮是多種慢性疼痛的特征之一。疼痛處理通路的第二站是脊髓背角，其接收來自外周的輸入并將信息傳遞到更高級別，參與不同疼痛模式和慢性疼痛的特定腦區(qū)和腦回路仍有待確定。在慢性疼痛轉錄的表觀遺傳調節(jié)背景下，大多數研究集中于外周感覺神經元或脊髓神經元，而有一小部分報告了慢性疼痛大腦區(qū)域的表觀遺傳介導轉錄。從機制上講，轉錄的表觀遺傳調控支持具有不同作用模式的慢性疼痛可塑性：① 通過調節(jié)關鍵通路表達來改變相關回路的興奮性；② 誘導或抑制突觸后受體和信號分子的表達；③ 促進不適應性的結構可塑性，如在突觸接觸或傳遞水平；④ 通過影響其反應性來改變將在疼痛介導中招募的細胞數量。
圖4：慢性疼痛的表觀遺傳機制
DNA甲基化水平、染色質結構和ncRNA變化可能影響不同基因表達，從而促進中樞和外周疼痛回路具有持久的可塑性，并最終導致慢性疼痛。
（1）慢性疼痛與DNA甲基化
在損傷后數周慢性神經性疼痛的動物模型中發(fā)現脊髓和DRG的全基因組DNA甲基化水平變化，表明DNA甲基化可能在持續(xù)性疼痛中起重要作用。除整體DNA甲基化水平變化外，許多研究還檢測到與慢性疼痛相關的特定基因啟動子區(qū)域甲基化水平增加。如神經性疼痛的嚙齒動物模型與Oprm1（encoding mu 76 opioid receptor, MOR）和Kcna2（Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily A Member 2）基因啟動子高甲基化相關，且與DNA甲基化在抑制基因表達中的作用一致，其蛋白水平降低。神經性疼痛用阿片類鎮(zhèn)痛作用降低，可能是MOR表觀遺傳下調；Kcna2表達水平是驅動DRG神經元興奮的重要原因。慢性疼痛中DNA甲基化水平變化并非嚴格單向升高，在特定啟動子區(qū)域也出現低甲基化，如神經性疼痛小鼠模型的脊神經結扎（SNL）編碼趨化因子受體3（CXCR3）和G蛋白偶聯受體151（GPR151）的基因啟動子區(qū)域甲基化水平較低。CXCR3在許多炎癥條件下的病理生理過程中起關鍵作用，與DRG和脊髓中的疼痛調節(jié)有關。GPR151與神經性慢性疼痛中的DRG過度興奮有關。甲基化水平變化在慢性炎癥或內臟疼痛等不同形式的慢性疼痛中有不同的甲基化水平。
大鼠或小鼠足底注射完全弗氏佐劑（CFA）是持續(xù)性炎性疼痛的最佳表征和使用模型之一，可引起NGF（神經生長因子）或胱硫醚-β-合酶（CBS）基因啟動子的去甲基化。DNA甲基化水平變化通過誘導或抑制DNMT表達實現，DNMT表達譜變化（雙向）發(fā)生在多種疼痛狀態(tài)的DRG和脊髓中。DNMT3a在慢性縮窄性損傷（CCI）和神經性疼痛的SNL嚙齒動物模型中均上調。以上研究沒有區(qū)分DNMT3a亞型DNMT3a2和DNMT3a1，但這兩種亞型在神經系統其他區(qū)域的表達和活性模式完全不同。在小鼠海馬體中，DNMT3a2表達受突觸活性調控并在刺激后誘導，而DNMT3a1的水平沒有變化。研究表明，慢性疼痛的相關誘導，DNMT3b表達在慢性疼痛條件下降低，且這種降低是炎癥和神經性疼痛中某些基因低甲基化原因。表觀遺傳標記readers證據進一步支持了DNA甲基化在慢性疼痛中的重要性。大鼠CFA處理后引發(fā)炎性疼痛，脊髓背角中MeCP2被磷酸化，從而失活。此外，MBD1丟失的小鼠表現出神經性疼痛超敏反應。
（2）慢性疼痛與組蛋白修飾
甲基化也可以發(fā)生在組蛋白上。在周圍神經損傷（一種神經性疼痛模型）中，損傷觸發(fā)不同電壓門控鉀通道（voltage-gated potassium channels）下調，促進慢性疼痛中DRG神經元的過度興奮。由于組蛋白甲基化酶G9a上調，H3K9me2組蛋白二甲基化在神經損傷后顯著增加。兩項嚙齒動物的獨立研究在功能上將G9a和H3K9me2過表達與電壓門控鉀通道下調相關聯，G9a屬于組蛋白甲基轉移酶超家族，在大鼠和小鼠神經損傷后與Oprm1（編碼阿片受體MOR）和大麻素受體1和2（CB1、CB2）表達變化有關，在疼痛調節(jié)中發(fā)揮重要作用，可以潛在解釋大麻素或阿片類藥物給藥在慢性疼痛患者中往往隨著時間而失效的藥理學模式。此外，兩種CB受體均與不同細胞類型的炎性疼痛調節(jié)相關，因此評估炎癥疼痛條件下CB受體表達的表觀遺傳調控是非常有意義的。
除賴氨酸甲基化外，精氨酸組蛋白甲基化也與疼痛有關；精氨酸特異性去甲基化酶JMJD6（含Jumonji結構域6）的表達在神經性疼痛的大鼠模型中發(fā)生變化。
針對炎癥和神經病變等不同疼痛模型描述了組蛋白乙?；阶兓?。組蛋白乙?；蹾AT和HDAC不同調控。一些研究采用不同的HDAC抑制劑來促進嚙齒動物模型的鎮(zhèn)痛，但由于研究出現矛盾的結果，無法根據這些研究描述一個清晰的機制情景。某些情況下藥物HDAC抑制改善了超敏反應，而在另一些情況下則使其惡化。有可能這些差異歸因于使用的HDAC抑制劑非特異性，決定性方法是針對不同HDAC，同時考慮其不同的激活模式。從這個角度來看，錐體神經元中II a類HDAC的HDAC4、5、7、9從細胞出核，將在刺激后失活。近期研究表明小鼠脊髓神經元的慢性炎性疼痛CFA模型中，傷害感受特異性地僅觸發(fā)HDAC4從背角神經元細胞出核。當抑制HDAC4出核時，超敏反應也受到抑制，而急性疼痛則不受影響。慢性炎性疼痛中脊髓背側HDAC4調控基因表達的下一代RNA測序，鑒定出一種新的中樞致敏介質——有機陰離子轉運蛋白1（OAT1），初級感覺神經元中條件性敲除HDAC4主要調節(jié)熱超敏反應。因此HDAC4在慢性疼痛中起關鍵作用，可能在取決于區(qū)域的調節(jié)敏感性方面具有雙重功能。未來的比較研究有望闡明HDAC4參與慢性疼痛可能通過抑制或誘導的基因、細胞類型和條件的特異性。組蛋白乙?；痳eaders與慢性疼痛之間聯系的證據較少，可能在不久后的新研究中有新發(fā)現。
（3）慢性疼痛與ncRNA
miRNA是ncRNA中疼痛研究中最多的一組，越來越多的研究文章揭示了它們在不同疼痛狀態(tài)下的調控和靶點，包括不同的神經性疼痛、炎性疼痛或癌癥疼痛模型。miRNA在多個層面上與慢性疼痛的不適應性變化有關：從初傳遞到DRG、脊髓和皮質區(qū)域?？傮w而言， miRNA在不同的疼痛模型中受調控的特異性非常高，使miRNA在慢性疼痛中的影響和功能作用的工作模型開發(fā)變得復雜。特異性miRNA可能在神經性疼痛中上調，但在炎性疼痛和癌痛中不受影響，甚至出現相反的表達調控。疼痛通路的敏感性由受體和通路變化引起，最終導致過度興奮。幾種鑒定或預測的miRNA靶基因屬于這一類，如靶向電壓門控鈣通道、電壓門控鉀通道及其調節(jié)亞基、電壓門控鈉通道的miRNA在大鼠神經性疼痛模型中發(fā)生變化。慢性疼痛的miRNA靶點也可以是關鍵信號元件或疼痛介質，如NGF、BDNF（腦源性神經營養(yǎng)因子）、NF-L（神經絲輕鏈）、AKT3（AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶3），同時miRNA可能影響其他表觀遺傳調節(jié)因子（MeCP2、Dnmt3a）。
近十年來，lncRNA在慢性疼痛中的研究領域迅速發(fā)展。從電壓門控鉀通道（Kv）Kcna2-AS-RNA的首次鑒定開始，lncRNA被定義為靶向神經性疼痛中Kcna2 mRNA的內源性反義轉錄本，在不同疼痛模型中鑒定的lncRNA與人疼痛慢性化相關。LncRNA具有不同的作用模式，可能與miRNA及其加工互作并干擾，或直接靶向參與疼痛加工的特定分子。
總結
盡管表觀遺傳機制在慢性疼痛中的作用已被廣泛接受，一些分子和細胞機制已被闡明，但該領域仍為進一步深入研究提供了許多機會，有望促進開發(fā)新的、更精細的慢性疼痛治療策略。
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參考文獻：
Mauceri D. Role of Epigenetic Mechanisms in Chronic Pain. Cells. 2022 Aug 22;11(16) pii: cells11162613. doi: 10.3390/cells11162613. PubMed PMID: 36010687.
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