2021年12月21日，美國阿肯色大學(xué)、德克薩斯大學(xué)和肯塔基大學(xué)的研究人員合作在《Aging Cell》雜志發(fā)表了題為“Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging”的Short Take研究論文，該研究通過使用簡化甲基化測序（RRBS）、核糖體DNA（rDNA）和線粒體特異性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和DNAge? 表觀遺傳衰老時鐘分析對小鼠自愿耐力/阻力運(yùn)動訓(xùn)練（漸進(jìn)式負(fù)重輪跑，PoWeR）的可翻譯模型，揭示運(yùn)動可以延緩骨骼肌的表觀遺傳衰老。
標(biāo)題：Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging晚年鍛煉延緩骨骼肌表觀遺傳衰老
時間：2021.12.21
期刊：Aging Cell
影響因子：IF 11.005
技術(shù)平臺：RRBS等
樣本實驗：
研究摘要：
包括骨骼肌在內(nèi)的所有組織在整個生命周期中都會發(fā)生DNA甲基化變化，且結(jié)構(gòu)和功能可能隨著年齡增長而下降。運(yùn)動訓(xùn)練會改變肌肉DNA甲基化，但是否會導(dǎo)致老年小鼠骨骼肌甲基化更接近年輕小鼠的甲基化尚不清楚。本研究對22-24月齡小鼠進(jìn)行漸進(jìn)式負(fù)重輪跑（PoWeR）的高容量阻力/耐力訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后，通過RRBS甲基化測序分析、核糖體DNA（rDNA）和線粒體特異性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和＞500個組織特異性小鼠CpG位點的高覆蓋率表觀遺傳衰老時鐘分析（DNAge?分析），評估運(yùn)動對骨骼肌表觀遺傳衰老的作用，并將結(jié)果與Horvath泛組織表觀遺傳衰老時鐘進(jìn)行重疊分析。結(jié)果表明22-24月齡的晚年小鼠PoWeR顯著減緩了與年齡相關(guān)的啟動子甲基化變化。PoWeR訓(xùn)練8周后的老年小鼠（aged PoWeR）肌肉表觀遺傳年齡大約比24月齡的久坐小鼠（aged sedentary）年輕8周，約占預(yù)期小鼠壽命的8%。這些數(shù)據(jù)為運(yùn)動減緩骨骼肌衰老提供了分子基礎(chǔ)。
研究結(jié)果
（1）骨骼肌的RRBS分析
與4月齡年輕小鼠相比，久坐的24月齡小鼠腓腸肌的啟動子區(qū)域（即轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 kb內(nèi)）的103個特異性CpG位點低甲基化（FDR＜0.05），而比對到133個不同基因中至少一個基因?qū)?yīng)的762個不同CpG位點高甲基化（FDR<0.05，圖1a）。對老年肌肉高甲基化啟動子基因的通路分析表明，三羧酸循環(huán)（TCA）調(diào)節(jié)（p=0.00572，q=0.125）中的過表達(dá)，特別是與NAD活性相關(guān)的基因（圖1b）。在外顯子區(qū)域比對到27個基因中至少一個基因?qū)?yīng)的68個CpG位點表現(xiàn)出低甲基化，而比對到146個基因中至少一個基因?qū)?yīng)的864個不同CpG位點在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（FDR<0.05，且老年久坐小鼠的內(nèi)含子甲基化模式相同；比對到131個基因中至少一個基因?qū)?yīng)的271個CpG位點低甲基化；而比對到301個基因中的至少一個基因?qū)?yīng)的2261個CpG位點高甲基化（FDR<0.05）。隨著年齡的增長，所有三個區(qū)域中（啟動子、外顯子、內(nèi)含子）沒有基因隨著年齡而低甲基化，而所有三個區(qū)域中有18個基因高甲基化。
圖1：年輕、老年久坐和老年漸進(jìn)式負(fù)重輪跑（PoWeR）小鼠肌肉中啟動子甲基化變化。
（a） 老年久坐小鼠與年輕小鼠腓腸肌中啟動子CpG甲基化百分比（距轉(zhuǎn)錄起始位點≤1 kb）（所有位點*FDR<0.05；相同CpG的老年P(guān)oWeR甲基化顯示為參考）。
（b） 與年輕小鼠相比，三羧酸（TCA）循環(huán)基因啟動子隨年齡增長而高甲基化，插圖顯示啟動子CpG平均甲基化。
（c） 與年輕小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因啟動子區(qū)域的低甲基化，但老年P(guān)oWeR小鼠中的基因未低甲基化。
（d） 與年輕小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因啟動子區(qū)域的高甲基化，老年P(guān)oWeR小鼠中的基因未高甲基化。
（e） Rbm10和Timm8a1啟動子區(qū)甲基化；x軸表示基因啟動子區(qū)中單個CpG位點的染色體位置。使用所有組的廣義線性模型來確定差異甲基化，通過使用Benjamini–Hochberg方法控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來校正多重比較（α=0.05）
（2）核糖體DNA（rDNA）甲基化和DNAge?分析
rDNA隨著年齡的增長而高甲基化，并具有高度保守的衰老甲基化時鐘。本研究在rDNA中鑒定出360個CpG位點，這些位點在老年小鼠和年輕小鼠肌肉中差異甲基化（FDR<0.05），其中15個位點低甲基化，345個位點高甲基化。在PoWeR訓(xùn)練后，久坐小鼠中有9個位點低甲基化（圖2a）。PoWeR訓(xùn)練將老年小鼠與年輕小鼠肌肉中11個位點的甲基化水平向年輕小鼠轉(zhuǎn)移（圖2b）。對增強(qiáng)子區(qū)域位點（CpG 43519）及其周圍的甲基化水平使用靶向高分辨率甲基化分析（平均每個rDNA CpG的覆蓋率>10000倍），結(jié)果表明與單獨(dú)衰老相比，運(yùn)動導(dǎo)致的更多甲基化水平，這些位點在年輕小鼠中無論運(yùn)動與否均呈現(xiàn)高甲基化水平。從RRBS分析可以得出結(jié)論，運(yùn)動可以改變老年肌肉中的rDNA甲基化，但靶基因分析揭示了reads覆蓋度對絕對甲基化水平的潛在影響（位點43519的RRBS覆蓋度平均為23倍）。
圖2：核糖體DNA（rDNA）甲基化和DNAge? 分析。
（a） 與年輕小鼠相比，rDNA CpG（按染色體位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中低甲基化（*FDR<0.05），但在老年P(guān)oWeR小鼠肌肉中未低甲基化。
（b） 與年輕小鼠相比，rDNA CpG（按染色體位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（*FDR<0.05），但在老年P(guān)oWeR小鼠肌肉中未高甲基化。
（c） 老年久坐小鼠與老年P(guān)oWeR小鼠肌肉的DNAge?分析，使用定向t檢驗分析。使用所有組的廣義線性模型來確定（a）和（b）中的差異甲基化，并通過使用Benjamini-Hochberg方法控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來校正多重比較（α=0.05）；直方圖用直線表示中位數(shù)。
PoWeR訓(xùn)練8周后的DNAge?分析對研究小鼠腓腸肌中年輕的表觀遺傳年齡足夠敏感，最近的進(jìn)展有望提高肌肉特異性甲基化的衰老時鐘的穩(wěn)健性和準(zhǔn)確性。未來的研究可能會闡明哪些運(yùn)動對DNAge的影響與衰老無關(guān)。在某些情況下，與其他相關(guān)因素（如體重或心肺功能）相比，年齡與肌肉功能障礙的相關(guān)性較小。不過運(yùn)動對減緩肌肉表觀遺傳衰老的研究結(jié)果支持了最近對人類的針對性觀察，且越來越多的證據(jù)表明運(yùn)動是延長健康壽命的一種策略。一旦肌肉纖維中動態(tài)DNA甲基化變化機(jī)制基礎(chǔ)得到更明確的定義，隨著年齡增長，改善肌肉健康將成為潛在可修飾的表觀遺傳標(biāo)記。
關(guān)于易基因簡化基因組甲基化測序（RRBS）研究解決方案
簡化甲基化測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，富集啟動子及CpG島等重要的表觀調(diào)控區(qū)域并進(jìn)行重亞硫酸鹽測序。該技術(shù)顯著提高了高CpG區(qū)域的測序深度，在CpG島、啟動子區(qū)域和增強(qiáng)子元件區(qū)域可以獲得高精度的分辨率，是一種準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)的DNA甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。
為適應(yīng)科研技術(shù)的需要，易基因進(jìn)一步開發(fā)了可在更大區(qū)域內(nèi)捕獲CpG位點的雙酶切RRBS(dRRBS)，可研究更廣泛區(qū)域的甲基化，包括CGI shore等區(qū)域。
為助力適用低起始量DNA樣本（5ng）量多維度甲基化分析，易基因開發(fā)了富集覆蓋CpG島、啟動子、增強(qiáng)子、CTCF結(jié)合位點的甲基化靶向基因組測序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），實現(xiàn)了高靈敏度和微量樣本復(fù)用檢測，使其具有高度可擴(kuò)展性，并適用于有限的樣本和單個細(xì)胞基因組CG位點覆蓋高達(dá)15M以上。
技術(shù)優(yōu)勢：
起始量：100ng gDNA；
單堿基分辨率；
多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性可達(dá)到85%-95%、測序區(qū)域針對高CpG調(diào)控區(qū)域，數(shù)據(jù)利用率更高；
針對性強(qiáng)，成本較低；
基因組CG位點覆蓋高達(dá)10-15M，顯著優(yōu)于850K芯片。
應(yīng)用方向：
RRBS/dRRBS/XRBS廣泛應(yīng)用于動物，要求全基因組掃描（覆蓋關(guān)鍵調(diào)控位點）的：
隊列研究、疾病分子分型、臨床樣本的甲基化 Biomarker 篩選
復(fù)雜疾病及腫瘤發(fā)病機(jī)制等甲基化研究
模式動物發(fā)育和疾病甲基化研究
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案，技術(shù)詳情了解請致電易基因。
參考文獻(xiàn)：
Klughammer J, et al. Comparative analysis of genome-scale, base-resolution DNA methylation profiles across 580 animal species. Nat Commun. 2023 Jan 16;14(1):232.
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