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結直腸癌（colorectal cancer ，CRC）是全球最常見的癌癥之一，轉移性CRC患者的5年生存率低于20%。免疫檢查點阻斷（Immune checkpoint blockade，ICB）對CRC患者表現(xiàn)出良好療效，然而只有一小部分高微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）或腫瘤錯配修復缺失（dMMR）的患者對ICB響應。
N6-甲基腺苷(m6A)是最豐富的RNA修飾之一。m6A reader，如YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白1/2/3（YTHDF1/2/3）、YTHDC1/2和IGF2BP1/2/3與m6A修飾的mRNA結合，以決定m6A修飾mRNA命運。YDHDF1、METTL3和ALKBH5等m6A調控因子已在癌癥中得到深入研究。據(jù)報道，在各種癌癥類型中，YTHDF1上調與癌癥不良預后相關，YTHFD1可促進腫瘤發(fā)生和癌癥轉移。然而，YTHDF1在腫瘤免疫微環(huán)境（tumour immune microenvironment，TIME）中的作用尚不清楚。
2023年01月30日，香港中文大學醫(yī)學院于君教授團隊以“Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer”為題在《Gut》雜志發(fā)表研究論文，研究通過甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）、RNA測序（RNA-seq）和核糖體測序（Ribo-seq）鑒定出YTHDF1的直接靶標，揭示YTHDF1通過m6A-p65-CXCL1/CXCR2軸抑制抗腫瘤免疫以促進CRC，可以作為免疫檢查點阻斷療法的治療靶點。
標題：Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer（靶向m6A reader YTHDF1可增強結直腸癌患者的抗腫瘤免疫并提高抗PD-1療效）
時間：2023.01.30
期刊：Gut
影響因子：IF 31.793
技術平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、Ribo-seq、scRNA-seq等
研究摘要
N6-甲基腺苷（m6A）在腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中的作用尚不清楚。本研究通過在組織微陣列(N=408)和癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA） (N=526)隊列中評估了YTHDF1的臨床意義，在同基因腫瘤、腸道特異性YTHDF1敲入（knockin）小鼠和人源化小鼠模型中鑒定YTHDF1功能。研究利用單細胞RNA-seq (scRNA-seq)以分析TIME；采用MeRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq以鑒定YTHDF1直接靶點；囊泡樣納米顆粒(vesicle-like nanoparticles，VNPs)包封的YTHDF1-siRNA用于體內YTHDF1沉默。
研究結果表明，在TCGA-CRC中，YTHDF1表達與干擾素-γ基因標記呈負相關。在獨立的組織微陣列隊列中，YTHDF1蛋白與CD8+ T細胞浸潤呈負相關，揭示了YTHDF1在TIME中的作用。在CT26（MSS-CRC）和MC38（MSI-H-CRC）同基因腫瘤中，YTHDF1基因缺失增強了抗腫瘤免疫，而在偶氮甲烷-葡聚糖硫酸鈉（azoxymethane-dextran sulphate-sodium）或+ApcMin/+模型中，YTHDF1敲入促進了CRC的免疫抑制TIME。scRNA-seq鑒定出YTHDF1敲除腫瘤中髓源性抑制細胞（MDSC）減少，同時伴有細胞毒性T細胞增加。整合的MeRIP-seq、RNA-seq和Ribo-seq分析鑒定出p65/Rela是YTHDF1的靶點。YTHDF1通過促進p65翻譯上調CXCL1，進而通過CXCL1-CXCR2軸促進MDSC遷移。增加的MSDC反過來在TIME中拮抗功能性CD8+ T細胞。另外，通過CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）或VNPs-siYTHDF1靶向YTHDF1增強了微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）和高微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）模型中的抗PD1療效，支持YTHDF1作為CRC免疫治療的治療靶點，闡明了YTHDF1在結直腸癌TIME中的功能和機制。
實驗材料
臨床樣本：兩個隊列的石蠟樣品用于建立組織微陣列（TMA）
隊列Ⅰ：206例CRC患者的手術切除組織
隊列Ⅱ：202例CRC患者的手術切除組織
人源化小鼠模型
腸道特異性Ythdf1敲入的小鼠CRC模型
TCGA數(shù)據(jù)
實驗結果
（1）YTHDF1與結直腸癌IFN-γ相關基因標記減少和預后不良有關，單細胞轉錄組揭示YTHDF1誘導的免疫抑制
圖1： YTHDF1與CRC患者的免疫抑制微環(huán)境相關，并通過免疫活性小鼠中進行scRNA-seq驗證。
TCGA數(shù)據(jù)集中干擾素-γ（IFN-γ）相關基因和m6A調控因子mRNA表達的Spearman相關性。
隊列I中通過免疫組化染色鑒定YTHDF1蛋白水平與CD8+T細胞浸潤的相關性（p<0.001，r=–0.2477，n=206）。
在隊列II中進行驗證（p<0.0001，r=?0.2686，n=202）。
通過FACS對有或沒有YTHDF1敲除的腫瘤中分選出CD45+細胞進行單細胞分析的實驗設計，隨后進行scRNA-seq。NC：具有對照sgRNA的細胞。YTHDF1-KO：YTHDF1敲除的CRISPR細胞。
C57BL/6小鼠中注射有或沒有YTHDF1敲除的MC38同基因腫瘤的代表性圖像（左）、腫瘤體積（中）和重量（右）。
（上）tSNE圖顯示有或沒有YTHDF1敲除的MC38同基因腫瘤中免疫細胞組分。（下）tSNE投影區(qū)域中顯示的T細胞和NK細胞簇亞群分析。
所有細胞類型的標記標志物表達水平標記圖，暗紅色至亮紅色表示低表達到高表達的表達水平。
流式細胞術的設門策略（Gating strategies）。髓源性抑制細胞（MDSC）、M-MDSC和G-MDSC的鑒定（左）。CD8+T和CD4+ T細胞的鑒定（中間）。顯示（D）中YTHDF1-KO腫瘤中IFN-γCD8+ T細胞增加的代表性圖像（右）。
對（D）中指定細胞的腫瘤進行流式細胞術分析（**p<0.01；***p<0.01）
（2）YTHDF1敲除可減少MDSC，但增加細胞毒性T細胞浸潤
圖2：YTHDF1敲除通過減少髓源性抑制細胞（MDSC）和增加同基因腫瘤中的功能性T細胞來誘導抗腫瘤免疫，但CD8+ T細胞缺失逆轉了這種效應。
（3）腸道特異性YTHDF1敲入可以促進小鼠結直腸腫癌發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
圖3：腸道特異性YTHDF1敲入可以促進小鼠結直腸癌發(fā)生并抑制抗腫瘤免疫
（4）通過VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1可以增強CD34+人源化小鼠模型的抗腫瘤免疫
圖4：VNP-siYTHDF1增強了CD34+人源化小鼠模型的抗腫瘤免疫力
（5）YTHDF1促進p65翻譯以激活TNF-κB信號通路
為確定YTHDF1誘導免疫抑制的分子機制，研究人員在有或沒有YTHDF1敲除的CRC細胞中進行了RNA-seq和Ribo-seq。通過RNA-seq分析，MC38-NC和MC38-YTHDF1-KO細胞間的差異表達基因在TNF和NF-κB信號通路中富集。并在另一種CRC細胞系CT26中獲得了一致的結果，表明YTHDF1調控TNF-κB信號通路。同時通過qPCR驗證了YTHDF1-KO降低了TNF-NF-κB靶點的mRNA表達。Ribo-seq數(shù)據(jù)表明，YTHDF1缺失與TNF信號通路失活顯著相關，YTHDF1敲除降低了參與TNF信號的基因核糖體保護片段豐度（圖5A）。因此，YTHDF1可以通過促進蛋白翻譯來調節(jié)TNF-κB信號通路。由于YTHDF1的m6A reader功能，通過m6A免疫沉淀測序（MeRIP-seq）以鑒定m6A修飾的轉錄本。通過篩選參與TNF信號通路的mRNA m6A peaks，鑒定出兩個p65 mRNA終止密碼子周圍的m6A位點（圖5B），并通過MeRIP-qPCR進行驗證（圖5C）。通過RNA免疫沉淀（RIP）測序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR鑒定出YTHDF1和p65 mRNA之間的直接互作（圖5D）。因此，p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點。另外，YTHDF1敲除可以降低CT26和MC38細胞中的p65蛋白表達，尤其是細胞核內的p65表達，但不影響NF-κB通路的其他調控因子（如IKKα和IκBα）的表達（圖5E）。
值得注意的是，在YTHDF1-KO細胞中，p65的mRNA表達沒有變化，支持YTHDF1主要在蛋白翻譯水平上調節(jié)p65，這與已報道的YTHDF1促進其靶標翻譯的功能一致。在人CRC細胞中獲得了一致的結果，表明野生型YTHDF1過表達可以上調p65蛋白表達；而YTHDF1敲低會降低CRC細胞中的p65蛋白表達（圖5F）。使用抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR也證實了人CRC細胞中YTHDF1和p65 mRNA之間的直接互作（圖5G）。體內驗證YTHDF1和p65的相關性實驗結果表明，在YTHDF1敲入小鼠中，CRC細胞中的p65和磷酸化p65蛋白均增加（圖5H）?？傊?， YTHDF1促進p65蛋白表達，以激活體內和體外TNF和NF-κB信號通路。
圖5： YTHDF1通過促進RELA（p65）mRNA翻譯以促進CRC TNF-κB信號通路。
有或沒有YTHDF1敲除的CT26細胞之間的差異表達基因在Ribo-seq鑒定的TNF信號通路中富集（左）。TNF信號通路基因熱圖（右）。
CT26細胞的MeRIP-seq測序分析結果表明RELA（p65）mRNA的最后一個外顯子（last exon）或3’UTR上的m6A修飾。
設計MeRIP-qPCR引物以驗證p65 mRNA上的m6A修飾。潛在的m6A位點以紅色標出（上），MeRIP-qPCR引物用箭頭表示。MeRIP-qPCR用引物#2和#3（較低）驗證了m6A修飾。
YTHDF1-RIP測序分析結果表明，與IgG對照相比，p65 mRNA富集（左）。YTHDF1-RIP-qPCR的小鼠p65 mRNA特異性引物（右）。
YTHDF1敲除的TNF/NF-κB信號通路關鍵效應因子的Western blot分析。
用過表達野生型（WT）或突變型（mut）YTHDF1或用shRNA敲低YTHDF1的人CRC細胞進行的Western blot分析。非靶向shRNA（shNC）作為對照。
YTHDF1-RIP-qPCR，與人p65 mRNA的特異性引物。
腸道特異性YTHDF1敲入小鼠和野生型同窩小鼠的結直腸癌細胞p65和磷酸化p65的表達Western blot分析，cKI：條件敲入（雙尾t檢驗（C,D,G））。
（6）YTHDF1通過p65-CXCL1軸促進MDSC遷移
圖6：YTHDF1敲除通過減少CXCL1分泌以促進髓源性抑制細胞（MDSC）的減少
（7）YTHDF1是結直腸癌免疫治療的潛在靶點
圖7：靶向YTHDF1可以增強高微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）和微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）結直腸癌（CRC）的抗PD1阻斷治療
關于易基因RNA m6A甲基化測序(MeRIP-seq)技術
易基因MeRIP-seq技術利用m6A特異性抗體富集發(fā)生m6A修飾的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），結合高通量測序，可以對RNA上的m6A修飾進行定位與定量，總RNA起始量可降低至10μg，最低僅需1μg總RNA。廣泛應用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥發(fā)生與發(fā)展、藥物應答等研究領域；可應用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測。
大樣本量m6A-QTL性狀關聯(lián)分析，傳統(tǒng)MeRIP單個樣品價格高，通常難以承擔。易基因開發(fā)建立MeRIP-seq2技術，顯著提成IP平行性，實現(xiàn)不同樣本間相對定量，降低檢測成本。
易基因提供適用于不同科研需求的MeRIP技術：
m6A甲基化-常量mRNA 甲基化測序（MeRIP-seq）
m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化測序（lnc-MeRIP-seq）
m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化測序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化測序（MeRIP-seq2）
技術優(yōu)勢：
起始量低：樣本起始量可降低至10-20μg，最低僅需1μg總RNA；
轉錄組范圍內：可以同時檢測mRNA和lncRNA；
樣本要求：可用于動物、植物、細胞及組織的m6A檢測；
重復性高：IP富集重復性高，最大化降低抗體富集偏差；
應用范圍廣：廣泛應用于組織發(fā)育、干細胞自我更新和分化、熱休克或DNA損傷應答、癌癥的發(fā)生與發(fā)展、藥物應答等研究領域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要運用在分子機制的理論性研究
疾病發(fā)生發(fā)展：腫瘤、代謝疾?。ㄈ绶逝?糖尿?。?、神經(jīng)和精神疾?。ㄈ绨柶澓ＤY/抑郁癥）、炎癥…
發(fā)育和分化：早期胚胎發(fā)育、個體/組織/器官生長發(fā)育、干細胞分化與命運決定、衰老
環(huán)境暴露與響應：污染、抗逆、生活方式
關于m6A甲基化研究思路
（1）整體把握m6A甲基化圖譜特征：m6A peak數(shù)量變化、m6A修飾基因數(shù)量變化、單個基因m6A peak數(shù)量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修飾基因的功能分析
（2）篩選具體差異m6A peak和基因：差異m6A peak鑒定、非時序數(shù)據(jù)的分析策略、時序數(shù)據(jù)的分析策略、差異m6A修飾基因的功能分析、差異m6A修飾基因的PPI分析、候選基因的m6A修飾可視化展示
（3）m6A甲基化組學&轉錄組學關聯(lián)分析：Meta genes整體關聯(lián)、DMG-DEG對應關聯(lián)、m6A修飾目標基因的篩選策略
（4）進一步驗證或后期試驗
易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整體解決方案。
參考文獻：
Bao Y, Zhai J, Chen H, Wong CC, Liang C, Ding Y, Huang D, Gou H, Chen D, Pan Y, Kang W, To KF, Yu J. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023 Jan 30.
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