熒光定量 PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，qPCR）也稱作實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。它是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)檢測整個(gè) PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對初始模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)于 1996 年由美國 Applied Biosystems 公司推出，它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng) PCR 不能對初始模板定量分析的問題。熒光定量 PCR 具有準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

熒光定量 PCR 原理

在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號，通過熒光強(qiáng)度變化檢測產(chǎn)物量的變化，最終得到得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分為三個(gè)階段：熒光背景信號階段（基線期）、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)；只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。

熒光定量 PCR 常用術(shù)語

在了解熒光定量 PCR 如何對初始模板進(jìn)行定量之前，需要了解幾個(gè)在熒光定量 PCR 分析中常用的術(shù)語：

l 基線：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的基線是指在 PCR 的最初幾個(gè)循環(huán)中（一般為 3-15 個(gè)循環(huán)）的信號水平。此階段的熒光信號變化量極小。低水平的基線信號相當(dāng)于反應(yīng)的背景或噪聲。每個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)的基線應(yīng)通過用戶分析或擴(kuò)增曲線自動(dòng)分析，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定?；€的設(shè)置，會(huì)影響到熒光閾值及 Ct 值。

l 熒光閾值：熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光閾值的缺省值是 PCR 反應(yīng)前 3-15 個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。

l CT 值：CT 值指的是 PCR 擴(kuò)增過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。

l 標(biāo)準(zhǔn)曲線：標(biāo)準(zhǔn)曲線是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的物理/化學(xué)屬性跟儀器響應(yīng)之間的函數(shù)關(guān)系。對已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做系列稀釋，對不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行熒光定量 PCR 并記錄 Ct 值，根據(jù) Ct 值及拷貝數(shù)的對數(shù)繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，橫坐標(biāo)代 Ct 值。

如何實(shí)現(xiàn)對初始模板的定量

利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對樣品的初始模板量進(jìn)行定量分析，需要利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過熒光定量 PCR 獲得未知樣品的 Ct 值，最后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)品的制備

設(shè)計(jì)特定引物，利用 PCR 對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將目的基因片段克隆至載體中，測序驗(yàn)證是否為陽性重組質(zhì)粒，最后收集陽性克隆質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定質(zhì)粒的濃度，依據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)粒的拷貝數(shù)。對質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，分別作為模板進(jìn)行熒光定量 PCR 并記錄Ct 值。最后依據(jù)起始拷貝數(shù)的對數(shù)及 Ct 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程。當(dāng)需要對起始模板進(jìn)行定量時(shí)，只需要得到擴(kuò)增曲線，讀得 Ct 值，帶入標(biāo)準(zhǔn)方程即可對起始模板定量。

熒光標(biāo)記方法

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 熒光標(biāo)記方法可分為熒光染料和熒光探針兩類，染料類熒光定量 PCR 是利用與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加；探針類熒光定量 PCR 是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。

熒光染料

染料法熒光定量 PCR 是利用熒光染料與雙鏈 DNA 小溝結(jié)合發(fā)光的理化特征指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加?，F(xiàn)以最常用的SYBR GreenⅠ為例，介紹染料法熒光定量 PCR 的工作原理：

SYBR GreenⅠ是一種熒光染料，可與雙鏈 DNA 非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈 DNA 結(jié)合，其熒光增加 1000 倍。一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的雙鏈 DNA 量呈比例，且會(huì)隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加，可通過熒光信號的增加來記錄產(chǎn)物的增加。

熒光探針

探針為一段寡核苷酸，可與 DNA 序列特異性結(jié)合，一個(gè)模板結(jié)合一個(gè)探針。探針 5’端具有報(bào)告基團(tuán)（R），可發(fā)熒光；3’端有熒光淬滅基團(tuán)（Q），能吸收熒光。探針完整時(shí) R 基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被 Q 基團(tuán)吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號。探針被酶水解后，R 與 Q 分開，PCR 儀可檢測到熒光信號。

Taq 酶有 5’→3’外切核酸酶活性可水解探針，在 PCR 延伸階段探針被 Taq 酶酶切降解，報(bào)告基團(tuán)（R）與淬滅基團(tuán)（Q）分離，熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。每擴(kuò)增一條 DNA 分子，釋放一個(gè)熒光信號，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步。

目前已經(jīng)開發(fā)出來的探針有 Taq Man 探針、Taq man MGB 探針、雙雜交探針、分子信標(biāo)、Lux 雜交探針、Simple proble 探針等。

探針法與染料法對比

熒光定量 PCR 應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床及生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達(dá)分析，基因突變和多態(tài)性分析，單核苷酸多態(tài) SNP 測定及易位基因的檢測；在醫(yī)療方面可用于免疫組化分析、臨床疾病早期診斷、病原體檢測、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等。（轉(zhuǎn)自先達(dá)基因 www.gendx.cn）