論文：CircRNA expression profiles in human visceral preadipocytes and adipocytes（人內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞內(nèi)CircRNA的表達(dá)譜）

摘要

環(huán)狀RNA(CircRNAs)調(diào)控多種生理和病理過(guò)程，但其在內(nèi)臟脂質(zhì)沉積中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從內(nèi)臟脂肪組織(HPA-v)誘導(dǎo)人前脂肪細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞，并利用crcRNA微陣列技術(shù)檢測(cè)HPA-v和脂肪細(xì)胞內(nèi)的crcRNA表達(dá)譜。

基因芯片數(shù)據(jù)顯示，與HPA-V相比，脂肪細(xì)胞中2,215和1,865個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別有明顯的上調(diào)和下調(diào)，而且，根據(jù)京都基因百科全書(shū)和基因組分析，差異表達(dá)的圓環(huán)RNA親本基因與脂肪酸代謝密切相關(guān)。

選擇hsa_CIRC_(0136134)、hsa_CIRC_(0017650)和hsa_cicRNA 9227~(-1)3種圓環(huán)RNA進(jìn)行定量PCR(QPCR)驗(yàn)證，其結(jié)果與芯片結(jié)果一致。

此外，還利用Miranda軟件預(yù)測(cè)微RNA(MiRNAs)可能針對(duì)前10位上調(diào)和下調(diào)的CircRNAs，以及14個(gè)miRNAs，其中有兩個(gè)以上的miRNA反應(yīng)元件針對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子。這是第一次研究圓環(huán)RNA在HPA-v和脂肪細(xì)胞中的表達(dá)譜，可能為內(nèi)臟肥胖提供潛在的治療靶點(diǎn)。

材料和方法

· 前脂肪細(xì)胞分化

· 油紅O染色

· 總RNA提取

· CircRNA微陣列分析

· 定量PCR

· 統(tǒng)計(jì)分析

Hpa-v分化

為獲得成熟的內(nèi)臟脂肪細(xì)胞，在含0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1M地塞米松和5g/ml胰島素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)HPA-v分化。通過(guò)油紅O染色和脂肪標(biāo)記基因表達(dá)的鑒定，證實(shí)了HPA-v的分化特征。

油紅O染色顯示分化后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量脂質(zhì)沉積。此外,PPARG 2、CEBPA和FABP 4成熟內(nèi)臟脂肪細(xì)胞mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)

RNA在HPA-v和脂肪細(xì)胞中的表達(dá)譜

為了研究圓環(huán)RNA是否與脂質(zhì)沉積有關(guān)，一種人圓環(huán)RNA微陣列(Version2.0；Agilent Technologies，Inc.)測(cè)定HPA-v和脂肪細(xì)胞內(nèi)圓環(huán)RNA的表達(dá)譜。用GeneSpringGX軟件，表明log 2比值在所有樣品中的分布是相似的。

繪制火山圖，比較hpa-v和脂肪細(xì)胞的圓環(huán)RNA表達(dá)譜。HPA-v和脂肪細(xì)胞之間差異表達(dá)的圓環(huán)RNA分別為≥5.0和P值≤0.0 1。與hpa-v相比，脂肪細(xì)胞共檢測(cè)到2,215個(gè)上調(diào)和1,865個(gè)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子。

列出前10位上調(diào)和下調(diào)的crna，而hsa_circ_0094183、hsa_circ_0116913在小鼠中同源的crcRNA分別為mu_circpedia_216382、mtu_circpedia_14213，而其他18個(gè)crna在小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們的同源圓環(huán)RNA。

采用層次聚類分析方法，對(duì)差異表達(dá)的圓環(huán)RNA的表達(dá)模式進(jìn)行了可視化分析。表明內(nèi)臟脂肪細(xì)胞與HPA-V之間有不同的表達(dá)周期RNA。

差異表達(dá)的圓環(huán)RNA的一般特征

分析了不同表達(dá)的圓環(huán)RNA在人類染色體上的分布，發(fā)現(xiàn)4,080個(gè)差異表達(dá)的圓環(huán)RNA來(lái)源于位于所有染色體上的基因，但在第13、18、21和Y染色體上很少。

對(duì)這些基因在親本中的分布進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3,968(97.25%)個(gè)圓環(huán)RNA定位于971個(gè)親本，其中437個(gè)(45.01%)親本基因產(chǎn)生一個(gè)圓環(huán)RNA，179(18.43%)個(gè)親本基因產(chǎn)生5個(gè)以上的圓環(huán)RNA。

圓環(huán)RNA親本基因的KEGG分析

為了研究不同表達(dá)周期RNA的潛在功能，利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)971個(gè)親本基因進(jìn)行了分析。最富集的前15條途徑，包括脂肪酸代謝、脂肪酸降解、脂肪酸生物合成和PPAR信號(hào)通路。最顯著的富集途徑是脂肪酸代謝(P=7.83E-08)，大多數(shù)基因參與代謝途徑(基因計(jì)數(shù)=104)。

環(huán)RNA-miRNA相互作用

為了分析差異表達(dá)的crna的潛在功能，我們預(yù)測(cè)了前10位上調(diào)和下調(diào)的crcRNAs的MERS。列出具有兩個(gè)以上MERS的miRNAs，目標(biāo)是前10位上調(diào)和下調(diào)的CircRNAs。

Hsa_CIRC_0136134、hsa_CIRC_0067409、hsa-圓環(huán)RNA 9227-1、hsa_CIRC_0060971、hsa_cicRNA 9333-2、hsa_CIRC_0052586和hsa-圓環(huán)RNA 2910-9分別與1、1、1、1、2、3和5 MERS相互作用。圓環(huán)RNA和miRNAs之間的相互作用還需要進(jìn)一步的研究。

討論

CircRNAs可以招募miRNAs來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。而且大多數(shù)圓環(huán)RNA都有一個(gè)以上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)；例如，cirs-7含有60多個(gè)miR-7的靶位點(diǎn)，可以作為miR-7海綿，影響miR-7靶基因的表達(dá)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)前10位上調(diào)和下調(diào)的crna有許多潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，例如hsa-圓環(huán)RNA 9227-1，它在內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中被上調(diào)。包含至少兩個(gè)hsa-miR-665的目標(biāo)站點(diǎn)。以前的研究表明，hsa-miR-665在人間充質(zhì)干細(xì)胞的脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中被下調(diào)，而賽平則促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化。

是miR-665的潛在靶基因。這些結(jié)果表明，hsa-cycRNA 9227-1參與了調(diào)節(jié)脂肪發(fā)生的過(guò)程，其機(jī)制是通過(guò)招募hsa-mir-665來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，圓環(huán)RNA作為miRNA海綿在內(nèi)臟脂質(zhì)沉積中的作用還需要更多的研究。

本研究對(duì)人內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的圓環(huán)RNA表達(dá)譜進(jìn)行了研究。兩種細(xì)胞類型的圓環(huán)RNA表達(dá)譜明顯不同，反映了它們與脂肪發(fā)生的密切聯(lián)系。需要進(jìn)一步研究圓環(huán)RNA在內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)沉積中的作用，以開(kāi)發(fā)新的治療肥胖的方法。

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