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著床失敗是導(dǎo)致早期流產(chǎn)的重要因素之一⁶。然而研究者們幾乎無法獲得自然受孕后的早期著床后階段的人類胚胎，導(dǎo)致人們對胚胎發(fā)育過程中這一關(guān)鍵階段的譜系特化和分子調(diào)控等規(guī)律知之甚少。猴子胚胎曾被用于早期胚胎發(fā)育研究⁷，但著床后早期胚胎的猴子模型與人類仍然存在一定的物種差異。小鼠作為最常見模式生物被廣泛應(yīng)用于早期胚胎研究。人類囊胚與子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系為模擬體內(nèi)著床后發(fā)育過程提供了另一實(shí)驗(yàn)策略⁸，然而這類研究策略對于著床后發(fā)育過程的重現(xiàn)程度和可重復(fù)性存在一定問題。尤其是該體系必須有母體組織的參與，因此較難被推廣使用，且無法應(yīng)用于胚胎的自主性構(gòu)建（self-organization）研究。2016年，Magdalena Zernicka-Goetz實(shí)驗(yàn)室建立了小鼠著床后胚胎的體外培養(yǎng)體系，該研究組利用獨(dú)特的培養(yǎng)條件將小鼠著床前的囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)，直至形成類似于著床后胚胎的三胚層結(jié)構(gòu)，為闡明早期著床后胚胎發(fā)育提供了重要實(shí)驗(yàn)手段⁹。

然而，不同哺乳動物胚胎類型之間存在較明顯的物種差異，說明從小鼠到人類之間的發(fā)育過程的研究推理從而獲得的有效結(jié)論非常有限，這意味著人類著床后胚胎形態(tài)學(xué)和分子調(diào)控等變化規(guī)律最好能直接通過人類胚胎研究來獲取。相比小鼠來說，人類囊胚形成過程中的分子和細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究仍然偏少，已有研究暗示二者在譜系分化和功能方面存在時間和潛能上的巨大差異¹⁰。Ali H. Brivanlou實(shí)驗(yàn)室以及Magdalena Zernicka-Goetz實(shí)驗(yàn)室近期將小鼠著床后胚胎培養(yǎng)體系進(jìn)一步發(fā)展至人類胚胎，新建的培養(yǎng)體系同樣能促進(jìn)人類胚胎在體外經(jīng)歷著床前向著床后的轉(zhuǎn)化與發(fā)育，培養(yǎng)體系無需母體組織參與；形態(tài)學(xué)證據(jù)揭示了在這一階段人類胚胎發(fā)育的主要特征，表明人類胚胎在著床后期具有自我構(gòu)建（self-organization）特性，這極大的豐富了人們對于人類胚胎著床這一生物學(xué)過程的認(rèn)識^1,11。

細(xì)胞身份識別和命運(yùn)取決于其基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，同時該網(wǎng)絡(luò)受到復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳學(xué)等機(jī)制調(diào)控。解析人類胚胎細(xì)胞基因表達(dá)的時空特異性模式對于了解胚胎早期發(fā)育過程至關(guān)重要。將單細(xì)胞分辨率組學(xué)檢測技術(shù)應(yīng)用于人類胚胎發(fā)育研究使人們精確認(rèn)識這一過程成為了可能。湯富酬課題組和喬杰課題組長期緊密合作，致力于包括著床前胚胎在內(nèi)的人類生殖系細(xì)胞發(fā)育過程中基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)調(diào)控特征和潛在的機(jī)制研究：2013年，結(jié)合湯富酬課題組發(fā)展的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)¹²，繪制了人類著床前胚胎的高精度單細(xì)胞基因表達(dá)特征圖譜（Nature Structural & Molecular Biology，2013）¹³；2014年，該課題組利用新發(fā)展的微量細(xì)胞DNA甲基化組測序技術(shù)系統(tǒng)解析了人類著床前胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化組重編程動態(tài)特征（Nature，2014）¹⁴；2018年，該團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞DNA甲基化高通量測序技術(shù)在單細(xì)胞水平解析了人類著床前胚胎發(fā)育的DNA甲基化組圖譜（Nature Genetics，2018）¹⁵。同年，他們利用單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)解析了人類著床前胚胎發(fā)育過程中DNA甲基化組和染色質(zhì)狀態(tài)組的重編程過程，以及染色質(zhì)狀態(tài)與DNA甲基化之間的相互關(guān)系（Nature Cell Biology，2018）¹⁶。以上各項(xiàng)研究極大豐富了人們對于人類著床前胚胎基因表達(dá)和表觀遺傳調(diào)控規(guī)律的認(rèn)知。此外，多個課題組曾利用一系列單細(xì)胞技術(shù)對人類著床前胚胎的分子表達(dá)譜進(jìn)行了系統(tǒng)性解析^17,18。然而受困于技術(shù)限制，胚胎著床這一關(guān)鍵發(fā)育階段的多維度分子表達(dá)特征，尤其是該過程中譜系特異性分子表達(dá)譜和潛在的調(diào)控規(guī)律長期以來一直是未解之謎。

為此，兩個課題組再次攜手合作，結(jié)合人類胚胎體外培養(yǎng)體系與單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)（單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和多組學(xué)測序），系統(tǒng)揭示了人類早期著床后胚胎發(fā)育過程中的分子表達(dá)圖譜，并在此基礎(chǔ)上挖掘了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、DNA甲基化動態(tài)特征等潛在分子調(diào)控機(jī)制。

1. 人類胚胎在囊胚階段后期具備體外自我生長能力（體外模擬胚胎著床）

為了證實(shí)胚胎在體外無母體組織參與情況下的著床過程，研究者根據(jù)已報(bào)道胚胎培養(yǎng)策略重現(xiàn)了胚胎形態(tài)學(xué)動態(tài)變化特征^1,11。證據(jù)顯示胚胎在無母體組織參與下能發(fā)育至第12/14天，胚胎逐漸呈現(xiàn)出特異性的形態(tài)學(xué)特征，例如滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞數(shù)量大幅度增加，上胚層逐漸形成羊膜腔以及原始內(nèi)胚層逐漸生長并逐漸包圍上胚層（圖1，視頻1）。根據(jù)國際倫理學(xué)準(zhǔn)則，研究者們在第14天終止了體外胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

圖1  人類胚胎體外模擬著床生長過程（day6-12）

 視頻1  人類圍著床時期胚胎三維重建結(jié)構(gòu)（day12）

2. 不同細(xì)胞譜系的關(guān)鍵發(fā)育特征以及特征性基因挖掘

圖2  人類圍著床時期胚胎的譜系鑒定和各自的發(fā)育學(xué)特征

另一方面，OTX2過去曾被報(bào)道是圍著床時期胚胎上胚層（EPI）多能性轉(zhuǎn)化（pluripotency transition）的重要標(biāo)志基因¹⁹，然而在本研究中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示OTX2主要表達(dá)在原始內(nèi)胚層（PE），而并非上胚層（EPI）。進(jìn)一步全胚胎免疫熒光染色顯示OTX2表達(dá)在部分原始內(nèi)胚層細(xì)胞中，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。這表明具有相同發(fā)育來源（內(nèi)細(xì)胞團(tuán)起源）的兩類細(xì)胞（上胚層細(xì)胞和原始內(nèi)胚層細(xì)胞）可能攜帶特殊基因表達(dá)痕跡（圖4）。這些數(shù)據(jù)提示該研究中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的潛在資源價(jià)值，新的譜系標(biāo)記基因鑒定可能有助于早期胚胎中的譜系鑒定和干/祖細(xì)胞衍生研究。

圖4 OTX2在圍著床時期胚胎的表達(dá)情況

圖5  滋養(yǎng)外胚層（TE）兩類亞群的特征性基因表達(dá)譜

4. X染色體劑量平衡

自1961年Lyon等人報(bào)道雌雄個體之間的X染色體劑量特征后，X染色體劑量平衡一直是發(fā)育生物學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)之一²⁰。X染色體失活（XCI）對于女性（XX）與男性（XY）之間X連鎖基因的劑量平衡具有重要意義，同時X染色體上調(diào)（XCU）對于X連鎖基因與常染色體基因之間的劑量平衡具有重要意義。2016年Fredrik Lanner團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道雌雄胚胎的X染色體劑量在囊胚階段幾乎已達(dá)平衡，且為X染色體阻滯模式（X-dampening，雌性細(xì)胞兩條X染色體劑量均部分下調(diào)）¹⁷。在本研究中，作者們捕獲到了多個階段的雌雄胚胎，這為系統(tǒng)揭示這一過程中的關(guān)鍵生物學(xué)細(xì)節(jié)提供了可能?？勺粉櫢改冈吹任换虮磉_(dá)的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序分析顯示，在可觀察事件窗口內(nèi)（day12以前），雌雄胚胎的X染色體劑量并未達(dá)到平衡，且雌性胚胎逐漸啟動并逐漸呈現(xiàn)出父源或者母源X染色體隨機(jī)失活趨勢（XCI）（圖6）。另一方面，X染色體劑量應(yīng)與常染色體基因的表達(dá)量平衡則需要雌性與雄性中的X染色體上調(diào)（XCU）來實(shí)現(xiàn)，在晚期胚胎單細(xì)胞中活躍的那條X染色體（雄性細(xì)胞中僅含一條X染色體，處于活躍狀態(tài)；雌性細(xì)胞則含有一條活躍的X染色體和一條失活的X染色體）需要上調(diào)表達(dá)劑量兩倍，達(dá)到跟同一個細(xì)胞中每個常染色體兩個拷貝同樣的表達(dá)劑量（X染色體/常染色體的表達(dá)劑量比從1：2上調(diào)到2：2）。該研究發(fā)現(xiàn)X染色體上調(diào)在著床階段的雌性和雄性胚胎細(xì)胞中均已經(jīng)啟動，但是還沒有達(dá)到上調(diào)兩倍表達(dá)劑量的完成狀態(tài)。此外，研究者們還發(fā)現(xiàn)圍著床時期胚胎還存在著一定程度的拷貝數(shù)變異（CNV），且拷貝數(shù)變異并未影響主要譜系的整體基因表達(dá)特征。

圖6  圍著床時期胚胎的X染色體劑量動態(tài)變化過程

5. 譜系特異性DNA甲基化動態(tài)變化規(guī)律

為進(jìn)一步分析胚胎著床過程中的基因組甲基化特征，研究者們利用該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建的單細(xì)胞多組學(xué)測序技術(shù)對三類細(xì)胞譜系的基因組甲基化過程進(jìn)行了深度分析。圍著床階段胚胎細(xì)胞在DNA甲基化特征水平分布成4個主要細(xì)胞群體（圖7）：囊胚期（day 6）上胚層/原始內(nèi)胚層/滋養(yǎng)外胚層、著床后時期（day8/10）上胚層、著床后時期（day8-12）原始內(nèi)胚層、以及著床后時期（day8-12）滋養(yǎng)外胚層。該結(jié)果說明三類細(xì)胞譜系在囊胚發(fā)育階段（著床前）具有相似的DNA甲基化模式，在著床后迅速獲得了各自獨(dú)特的DNA甲基化特征。

圖7 各個細(xì)胞譜系在著床過程中的具有特異性DNA甲基化特征（基于PCA分析）

圖8 三類主要譜系在圍著床發(fā)育時期的DNA甲基化水平動態(tài)變化過程

湯富酬，博士，北京大學(xué)BIOPIC/ICG中心研究員，國家“優(yōu)青”（2013）和“杰青”（2016）。1998 年本科畢業(yè)于北京大學(xué)，2003 在北大獲得細(xì)胞生物學(xué)博士學(xué)位，2004 – 2010年間在英國劍橋大學(xué)Gurdon研究所從事博士后研究， 2010年回到北京大學(xué)組建實(shí)驗(yàn)室，主要從事人類早期胚胎發(fā)育的單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究。在國際上率先系統(tǒng)發(fā)展了單細(xì)胞功能基因組學(xué)研究體系，并利用一系列技術(shù)體系對人類早期胚胎發(fā)育進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究，揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化過程的異質(zhì)性以及其他表觀遺傳學(xué)關(guān)鍵特征，發(fā)現(xiàn)了人類早期胚胎中基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的重要表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)理，為人們提供了一個全面分析人類早期胚胎表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究框架，加深了對人類原始生殖細(xì)胞的發(fā)育以及表觀遺傳重編程過程的認(rèn)識?，F(xiàn)已發(fā)表論文110余篇，被同行引用8000余次。其中40多篇論文以通訊（或者共同通訊）作者身份發(fā)表在Cell，Nature，Science，Cell Stem Cell，Nature Cell Biology, Cell Research，Genome Research，Genome Biology等期刊上。其中兩項(xiàng)工作分獲評2014年度中國科學(xué)十大進(jìn)展和2015年度中國科學(xué)十大進(jìn)展。此外，湯富酬教授還曾獲得“顧孝誠講座獎”（2015）、第九屆談家楨生命科學(xué)創(chuàng)新獎（2016）、第二屆普洛麥格生物化學(xué)獎（2016）、拜耳學(xué)者獎（2017）和第十九屆吳階平-保羅·楊森醫(yī)學(xué)藥學(xué)獎（2017）等。

喬杰，醫(yī)學(xué)博士，北京大學(xué)BIOPIC/ICG中心研究員，中國工程院院士，北京大學(xué)第三醫(yī)院院長?，F(xiàn)任國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心主任，中國女醫(yī)師協(xié)會會長，中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會主任委員，中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會委員會副主任委員，《Human Reproduction Update 中文版》主編，《NEJM醫(yī)學(xué)前沿》特聘顧問等。1987年本科畢業(yè)于北京醫(yī)科大學(xué)，1996年獲得北京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位；曾赴美國斯坦福大學(xué)做博士后研究，并于香港大學(xué)瑪麗醫(yī)院做訪問學(xué)者。喬杰多年來一直從事婦產(chǎn)及生殖健康相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究工作，領(lǐng)導(dǎo)團(tuán)隊(duì)不斷揭示常見生殖障礙疾病病因及診療策略、創(chuàng)新生育力保存綜合體系并從遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)角度對人類早期胚胎發(fā)育機(jī)制進(jìn)行深入了研究。在此基礎(chǔ)上，開發(fā)新的胚胎基因診斷技術(shù)，為改善女性生育力、防治遺傳性出生缺陷做出重要貢獻(xiàn)，大力推動了我國女性生殖健康科研事業(yè)發(fā)展。帶領(lǐng)北醫(yī)三院團(tuán)隊(duì)每年診治疑難不孕患者60萬人次。作為第一或責(zé)任作者在Lancet、Science、Cell、Nature、JAMA、Nature Genetics等國際頂尖知名雜志發(fā)表SCI文章200余篇。

周帆，博士，北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）博士后，從事早期胚胎發(fā)育與單細(xì)胞功能與組學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究，合作導(dǎo)師為湯富酬教授。博士階段于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉兵教授團(tuán)隊(duì)從事造血干細(xì)胞發(fā)育研究，曾利用首創(chuàng)的單細(xì)胞誘導(dǎo)移植體系，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)系統(tǒng)揭示了小鼠造血干細(xì)胞的胚胎起源過程，首次精準(zhǔn)解析了“內(nèi)皮-造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化”過程中的基因表達(dá)規(guī)律，并深入探討了調(diào)控造血干細(xì)胞發(fā)生的潛在分子機(jī)制（Zhou et al., Nature, 2016）。同年受邀參加2016年國際實(shí)驗(yàn)血液學(xué)峰會（ISEH, San Diego, USA），并作大會報(bào)告。2016年獲華人生命科學(xué)博士生最高獎項(xiàng)-吳瑞獎，同年獲北大-清華生命聯(lián)合中心博士后基金（特等）資助，并獲中國博士后基金會支持（2016，面上資助；2016年，特別資助）；2017年入選中國科協(xié)青年人才托舉工程，并獲拜耳-北京大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心拜耳博士后獎。2019年在北京大學(xué)湯富酬實(shí)驗(yàn)室結(jié)合人類胚胎體外模擬著床體系與單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)解析了人類胚胎著床這一近乎“黑匣子”發(fā)育階段的分子表達(dá)規(guī)律和潛在分子調(diào)控機(jī)制（Zhou et al., Nature, 2019）。周帆博士未來將深度整合單細(xì)胞精度的功能學(xué)鑒定分析和單細(xì)胞組學(xué)分析等前沿技術(shù)體系，繼續(xù)圍繞“胚胎發(fā)育與疾病演化過程中的細(xì)胞命運(yùn)決定/轉(zhuǎn)化規(guī)律與調(diào)控機(jī)制”方向展開新的探索。

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參考文獻(xiàn)