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盡管自然界細(xì)胞形態(tài)多樣，功能各異，但其化學(xué)成分基本相似，主要包括：糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸、酶類(lèi)等。

第五節(jié)   核酸

    天然的核酸可分為兩大類(lèi)：核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。真核細(xì)胞中，RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在細(xì)胞核內(nèi)僅有少量存在，線粒體、葉綠體內(nèi)也有分布；DNA主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體、葉綠體內(nèi)也有少量存在。

    (一)核酸的組成成分

    將核酸水解可以得到核酸的基本組成單位——核苷酸，而核苷酸還可以進(jìn)一步分解成核苷和磷酸。核苷又可進(jìn)一步分解成堿基和戊糖。

    1、戊糖

    組成核酸的戊糖有兩種：β-D-核糖和β-D-2-脫氧核糖。前者存在于RNA，后者存在于DNA。

    2、堿基

    堿基分為兩類(lèi)：一類(lèi)是嘌呤，為雙環(huán)分子，一般有腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌吟(G)兩種；另一類(lèi)是嘧啶，為單環(huán)分子，一般有胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)三種。DNA中含有A、G、C、T，RNA中含有A、G、C、U。凡含有酮基的嘧啶堿或膘吟堿，在溶液中可以發(fā)生酮式和烯醇式的互變異構(gòu)現(xiàn)象。結(jié)晶狀態(tài)時(shí)，為這種異構(gòu)體的等量混合物。在生物體內(nèi)則以酮式占優(yōu)勢(shì)，這對(duì)核酸分子中氫鍵結(jié)構(gòu)的形成非常重要。

    在核酸中還存在少量其他修飾堿基。核酸中的修飾堿基多是4種主要堿基的衍生物，大多是甲基化堿基，都是在核酸生物合成后，酶促加工修飾而成。這些修飾堿基對(duì)核酸的生物功能具有重要的作用。tRNA的修飾堿基種類(lèi)較多，如次黃嘌呤、二氫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶。

    3、核苷

戊糖C－l’的羥基與嘧啶堿N－l或嘌呤堿N－9上的氫縮合連接成共價(jià)的β-N-糖苷鍵。形成核苷。由核糖組成的核苷為核糖核苷，用單符號(hào)（A、G、C、U）表示，由脫氧核糖構(gòu)成的核苷，稱(chēng)脫氧核苷，則在單個(gè)符號(hào)前加一個(gè)小寫(xiě)的d（dA、dG、dC、dT）。

在tRNA中存在少量5-核糖尿嘧啶，是一種碳苷，其C－1’是與尿嘧啶的第5個(gè)碳原子相連，因?yàn)槲焯桥c堿基連接方式比較特殊．也稱(chēng)假尿苷苦．用符號(hào)Ψ表示。

4、核苷酸

    核苷酸是核苷的磷酸酯。核糖核苷酸的核糖有3個(gè)自由的羥基，因此磷酸酯化分別可生成2′-、3′-和5′-核苷酸。脫氧核苷酸的糖上只有兩個(gè)自由羥基，只能生成3′-和5’-脫氧核苷酸。生物體內(nèi)的游離核苷酸多為5′-核苷酸。

    (二)核酸的結(jié)構(gòu)

     1、DNA的結(jié)構(gòu)

    （1）一級(jí)結(jié)構(gòu)

    構(gòu)成DNA的脫氧核苷酸之間，由前一個(gè)殘基的脫氧核糖3′-羥基與后一個(gè)殘基脫氧核糖的5′-磷酸形成：3′，5′-磷酸二酯鍵，彼此相連而形成多脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈(圖1-1-12)。整個(gè)長(zhǎng)鏈有兩個(gè)游離的末端：脫氧核糖5'-OH末端(稱(chēng)5′-末端)和脫氧核糖3′-OH末端(稱(chēng)3′-末端)，長(zhǎng)鏈由5′-末端向3′-末端的延伸(5′-末端→3′-末端)。

    DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)就是指脫氧核苷酸鏈中脫氧核苷酸的排列順序。不同的DNA分子具有不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即含有的脫氧核苷酸數(shù)目不同，四種堿基的比例不同，排列順序也不同。

    （2)二級(jí)結(jié)構(gòu)

    根據(jù)Chargaff發(fā)現(xiàn)的A=T、G=C的堿基組成規(guī)律以及Wilkins和Franklin的DNA晶體的X光衍射實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，1953年Watson和Crick提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型(如圖1-1-13)。

該模型認(rèn)為：①DNA分子由兩條多脫氧核苷酸鏈反向平行(一條鏈?zhǔn)?/span>3′→5′，另一條鏈為5’一3′)，圍繞著同一個(gè)軸，右手盤(pán)旋成一個(gè)右平行螺旋結(jié)構(gòu)，螺旋的直徑為2.0nm；②磷酸和脫氧核糖在螺旋體的外側(cè)，通過(guò)磷酸二酯鍵連結(jié)形成DNA分子的骨架；③堿基對(duì)位于螺旋體內(nèi)側(cè)，按A與T，C與G配對(duì)，A-T對(duì)有2個(gè)氫鍵，C-G對(duì)有3個(gè)氫鍵，堿基平面與縱軸垂直，每個(gè)堿基對(duì)間相隔0.34nm，旋轉(zhuǎn)方向相差360°，因此繞中心軸每旋轉(zhuǎn)一圈有10個(gè)核苷酸，每隔3.4nm重復(fù)出現(xiàn)同一結(jié)構(gòu)；④螺旋表面有一條大溝和一條小溝，這兩條溝對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的相互識(shí)別是很重要的。

    DAN雙螺旋結(jié)構(gòu)很穩(wěn)定，有3種化學(xué)鍵維持：互補(bǔ)堿基之間的氫鍵，堿基對(duì)之間的堿基堆集力，以及主鏈上帶負(fù)電的磷酸與溶液陽(yáng)離子之間的離子鍵，其中堿基堆集力起主要作用。

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在不同濕度條件下，含不同鹽離子的DNA結(jié)晶，其X光衍射圖譜也不同，說(shuō)明有不同的雙螺旋構(gòu)象。據(jù)此，又可將DNA分為A型、B型、C型、D型和Z型等多種構(gòu)象。

    (3)三級(jí)結(jié)構(gòu)

    DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指雙螺旋DNA的扭曲或再螺旋、超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本形式。

    絕大多數(shù)原核生物以及線粒體和葉綠體的DNA是共價(jià)環(huán)雙鏈DNA，這種環(huán)狀雙螺旋DNA分子，如果通過(guò)細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，即可在環(huán)形分子的內(nèi)部引起張力，這種新產(chǎn)生的張力不能釋放到分子外部，而只能在DNA分子內(nèi)部促使原子的位置重排，造成雙螺旋的再螺旋，形狀似麻花，即產(chǎn)生超螺旋結(jié)構(gòu)。

    真核細(xì)胞染色質(zhì)和有些病毒DNA是雙螺旋線形分子，當(dāng)線形DNA分子的兩端均固定時(shí)也可形成超螺旋結(jié)構(gòu)。染色質(zhì)DNA中雙螺旋DNA分子先盤(pán)繞組蛋白形成核小體，許多核小體由DNA鏈連在一起構(gòu)成念珠狀結(jié)構(gòu)，念珠狀結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步盤(pán)繞壓縮成更高層次的結(jié)構(gòu)-據(jù)估汁，人的DNA分子在染色質(zhì)中反復(fù)折疊盤(pán)繞，共壓縮8000～10000倍。

    2、RNA的結(jié)構(gòu)

    RNA主要有三大類(lèi)，分別是：核糖體RNA(rRNA)，占RNA總量的80％以上，是核糖體的主要成分；轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(1RNA)，占總量的15％，在蛋白質(zhì)的合成中搬運(yùn)氨基酸；信使RNA(mRNA)，占總量的5％，是合成蛋白質(zhì)的模板。不同種類(lèi)的RNA結(jié)構(gòu)各不相同，為了表述方便，將mRNA作為一級(jí)結(jié)構(gòu)的例子，tRNA作為二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的例子。

    (1)一級(jí)結(jié)構(gòu)

    RNA分子的基本結(jié)構(gòu)是一條線形的多核苷酸鏈，由四種核苷酸以3′，5’-磷酸二酯鍵連接而成。RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指RNA鏈上的核苷酸順序以及各功能部位的排列順序。

    mRNA是以DNA為模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，一般原核mRNA直接轉(zhuǎn)錄生成，而真核mRNA首先形成的是分子大小極不均一的hnRNA，再經(jīng)過(guò)加工成為成熟的mRNA。原核mRNA一般為多順?lè)醋?，即一條mRNA鏈含有指導(dǎo)合成幾種蛋白質(zhì)的信息。它的5′-末端和3′-末端無(wú)特殊結(jié)構(gòu)。在分子內(nèi)部，一個(gè)順?lè)醋拥木幋a區(qū)，是從起始密碼AUG開(kāi)始，到終止密碼UAG為止，各順?lè)醋拥木幋a區(qū)之間，以及5′端第一個(gè)順?lè)醋拥木幋a區(qū)之前，3′端最后一個(gè)順?lè)醋泳幋a區(qū)之后，都含有一段非編碼區(qū)。真核mRNA一般為單順?lè)醋樱粭lRNA只翻譯產(chǎn)生一種多肽鏈。真核細(xì)胞成熟mRNA分子3’端有150-200個(gè)腺苷酸(A)順序，即多聚腺苷酸(polyA)，它的作用可能是使mRNA分子穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；5′端是一個(gè)甲基化的鳥(niǎo)苷酸，即G-帽，它除起保護(hù)作用外，還使mRNA分子識(shí)別核糖體，和核糖體結(jié)合，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。

    (2)二級(jí)結(jié)構(gòu)

    RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指單鏈RNA自身回折，鏈內(nèi)的互補(bǔ)堿基對(duì)形成的局部雙螺旋區(qū)與非配對(duì)順序形成的突環(huán)相間分布的花形結(jié)構(gòu)。

    tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草型的，一般由四臂四環(huán)組成(分子中由A-U、C-C堿基對(duì)構(gòu)成的雙螺旋區(qū)叫臂，不能配對(duì)仍顯單鏈的部分叫環(huán))。四環(huán)是：D環(huán)(I)、反密碼子環(huán)(Ⅱ)、TΨC環(huán)(Ⅳ)和可變環(huán)(Ⅲ)，四臂為氨基酸接受臂、D臂、反密碼子臂和TΨC臂。在氨基酸接受臂，3’-OH端有一個(gè)單鏈區(qū)CCA-3’-OH，在氨基酸合成酶的作用下，活化了的氨基酸連接tRNA分子末端腺苷3’-OH上；在反密碼子環(huán)上其中有3個(gè)堿基代表著某種氨基酸的反密碼子，正好與mRNA配對(duì)，如圖1-1-14所示。

    (3)三級(jí)結(jié)構(gòu)

    RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中還要進(jìn)一步回折扭曲，以使分子內(nèi)部的自由能達(dá)到最小值；在二級(jí)結(jié)構(gòu)中突環(huán)上未配對(duì)的堿基，由于RNA鏈的再度扭曲而與另一突環(huán)上的未配對(duì)堿基相遇，形成新的氫鍵配對(duì)關(guān)系，其結(jié)果使平面的二級(jí)結(jié)構(gòu)變成立體的三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖l-1-15所示。tRNA的三葉形的二級(jí)結(jié)構(gòu)變成三級(jí)結(jié)構(gòu)的倒L型，tRNA發(fā)揮生物功能以其倒L型三級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。

    (三)核酸的性質(zhì)

    1、一般理化性質(zhì)

    核酸既有磷酸基，又有堿性基團(tuán)，是兩性電解質(zhì)，因磷酸的酸性強(qiáng)，通常表現(xiàn)為酸性。DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，都微溶于水，不溶于一般有機(jī)溶劑，常用乙醇從溶液中沉淀核酸。D-核糖與濃鹽酸和苔黑酚(甲基間苯二酚)共熱產(chǎn)生綠色，D-2-脫氧核糖與酸和二苯胺一同加熱產(chǎn)生藍(lán)紫色?？衫眠@兩種糖的特殊顏色反應(yīng)區(qū)分DNA和RNA或作為二者測(cè)定的基礎(chǔ)。

    2、核酸的紫外吸收性質(zhì)

    核酸中的嘌呤和嘧啶環(huán)的共軛體系強(qiáng)烈吸收260-290nm波段紫外光，最大吸收值在260nm處。利用這一特性可以對(duì)核酸進(jìn)行定性和定量測(cè)定。如待測(cè)DNA或RNA樣品的純度，可用它們的A260／A280的比值來(lái)判斷，純DNA溶液的A260／A280比值為1.8，而純RNA溶液的比值為2.0，樣品中若含有蛋白質(zhì)，則A260／A280的比值要下降，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的最大吸收峰在280nm。純核酸在變性時(shí)，吸收值顯著升高，稱(chēng)為增色效應(yīng)。在一定條件下，變性的核酸可復(fù)性，則吸收值又回復(fù)至原來(lái)水平，稱(chēng)減色效應(yīng)。

    3、核酸的變性和復(fù)性

    核酸的變性是指雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀態(tài)的過(guò)程。變性只涉及次級(jí)鍵的變化，而不涉及磷酸二酯鍵的斷裂，故一級(jí)結(jié)構(gòu)并不發(fā)生破壞(磷酸二酯鍵的斷裂稱(chēng)為核酸降解)。核酸變性以后，紫外吸收值明顯升高，黏度下降，浮力密度升高，生物功能部分或全部喪失。引起核酸變性的因素很多，如溫度、有機(jī)溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑均可以使核酸變性。DNA熱變性是爆發(fā)式的，只在很窄的溫度范圍之內(nèi)發(fā)生。通常將熱變性溫度稱(chēng)為“熔點(diǎn)”或解鏈溫度，用Tm表示。DNA的解鏈溫度Tm是指增色效應(yīng)達(dá)到最高值一半時(shí)的溫度。 Tm值與堿基組成有關(guān)，C—C含量高的核酸，Tm值也高，兩者成正比，可用經(jīng)驗(yàn)公式表示：(G-C)％=(Tm—69．3)X2．44。

    DNA復(fù)性是指變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過(guò)程。變性核酸復(fù)性時(shí)需緩慢冷卻，故又稱(chēng)退火。在退火條件下，不同來(lái)源的DNA互補(bǔ)區(qū)形成雙鏈，或DNA單鏈和RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)形成DNA-RNA雜交雙鏈，此過(guò)程稱(chēng)分子雜交。分子雜交技術(shù)在核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究上是一個(gè)重要手段。