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微生物富集方法使得從富含宿主的樣本中進(jìn)行高通量宏基因組表征成為可能

Microbial-enrichment method enables high-throughput metagenomic characterization from host-rich samples

Article，2023-10-12，Nature Methods， [IF 48]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41592-023-02025-4 

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-023-02025-4 

第一作者：Natalie J. Wu-Woods, Jacob T. Barlow

通訊作者：Rustem F. Ismagilov

合作作者：Florian Trigodet, Dustin G. Shaw, Anna E. Romano, Bana Jabri, A. Murat Eren

主要單位：

加州工學(xué)院(Biology and Bioengineering, California Institute of Technology, Pasadena, CA, USA. Department of Medicine)

芝加哥大學(xué)(The University of Chicago, Chicago, IL, USA)

Committee on Immunology, The University of Chicago, Chicago, IL, USA. 

Department of Pathology, The University of Chicago, Chicago, IL, USA. Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology, Pasadena, USA. 

Bay Paul Center, Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, USA. 

德國(guó)奧爾登堡大學(xué)(Institute for Chemistry and Biology of the Marine Environment, University of Oldenburg, Oldenburg, Germany) 

Alfred-Wegener-Institute for Marine and Polar Research, Bremerhaven, Germany. Helmholtz Institute for Functional Marine Biodiversity, Oldenburg, Germany.

目前，主要通過基于16S核糖體RNA基因測(cè)序的微生物分類鑒定，已經(jīng)確定了宿主與微生物間的相互作用與宿主健康和疾病有緊密關(guān)聯(lián),但許多關(guān)鍵機(jī)制仍待揭示。其中一個(gè)難點(diǎn)是，在宿主DNA與微生物DNA比例極高的樣本中，研究與哺乳動(dòng)物組織關(guān)聯(lián)的微生物基因組異常困難。在本研究中，我們提出了一種名為MEM（microbial-enrichment method；MEM）的微生物富集方法，并對(duì)其在多種類型的樣本上進(jìn)行了驗(yàn)證，如唾液、糞便、腸道刮片和腸黏膜活檢。MEM通過在微生物群落變化最小的情況下（大約90%的微生物種類在處理與未處理樣本間無顯著差異）將宿主DNA減少1000倍以上，實(shí)現(xiàn)了對(duì)人類腸道活檢微生物宏基因組的高通量表征。隨機(jī)（Shotgun）宏基因組測(cè)序經(jīng)過MEM處理的人類腸道活檢樣品能夠表征沿胃腸道縱向的高豐度和低豐度微生物分類群、代謝通路和功能基因。此外，我們還從人類腸道活檢中成功構(gòu)建了相對(duì)豐度低至1%的細(xì)菌和古細(xì)菌的宏基因組組裝基因組（metagenome-assembled genomes；MAG）。進(jìn)一步對(duì)宏基因組組裝基因組的分析揭示了某些微生物在小腸與大腸間具有不同的亞群結(jié)構(gòu)。MEM技術(shù)為微生物組學(xué)領(lǐng)域開辟了新的途徑，使我們能夠更深入地理解與宿主組織相關(guān)的微生物群落，從而更深刻地揭示宿主和微生物之間的相互作用。

腸道黏膜上的微生物群落與包括癌癥、炎癥性腸病(IBD)以及乳糜瀉在內(nèi)的眾多健康問題息息相關(guān)。盡管大便和腸道活檢中的微生物有著不同的生態(tài)位，但由于采樣方便，大多數(shù)微生物組學(xué)研究多使用糞便樣本來推測(cè)胃腸道(GI)中的微生物。而且大部分都采用16S核糖體RNA (rRNA)基因擴(kuò)增子的測(cè)序來描述微生物群落分類。近年來，由于宏基因組測(cè)序能夠提供更為深入的微生物基因組特征而被廣泛應(yīng)用于人類微生物生態(tài)學(xué)研究。此外，宏基因組測(cè)序還可以解析單一分類群內(nèi)的亞種結(jié)構(gòu)，例如生理上的宿主梯度如何在微生物組上施加進(jìn)化壓力，并對(duì)研究哪些微生物基因在不同宿主環(huán)境下受到選擇壓力均具有重要作用。

人們對(duì)組織相關(guān)微生物如何與宿主環(huán)境相互作用的分子機(jī)制仍缺乏足夠的了解，因?yàn)樵擃I(lǐng)域缺乏相稱的工具來超越分類解析并直接從腸道活檢樣本中研究微生物代謝通路和功能基因。全基因組表征的兩種常見方法包括培養(yǎng)微生物分離物或直接從混合的微生物樣本中重構(gòu)宏基因組組裝的基因組（MAG）。依賴培養(yǎng)的方法有一定作用；然而，獨(dú)立于培養(yǎng)的方法對(duì)于從其原始環(huán)境中描述微生物，以及那些難以分離的微生物而言具有重要價(jià)值。MAG是通過測(cè)序及先進(jìn)的算法創(chuàng)建的，其中測(cè)序讀序被組裝成連續(xù)的序列，然后被分組到單獨(dú)的分箱(bins)中，以在不培養(yǎng)的情況下重構(gòu)完整的基因組。

宏基因組測(cè)序?qū)?fù)雜的宿主相關(guān)微生物組的分析受到了樣品中存在的宿主與微生物核酸高比率的挑戰(zhàn)。在人類樣品中，唾液樣本中的85-95%讀序是宿主的，而腸道活檢中超過99.99%是宿主的。這些宿主與微生物DNA的巨大比率（在人腸道活檢中為1:10,000）對(duì)于宏基因組測(cè)序研究提出了巨大挑戰(zhàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)測(cè)序序列與宿主基因組一致。直接使用當(dāng)前的分析方法和測(cè)序深度對(duì)這樣的組織樣本無法產(chǎn)生足夠的微生物測(cè)序序列來構(gòu)建MAG。

為了防止大多數(shù)的宏基因組測(cè)序序列分配給宿主，已經(jīng)開發(fā)了各種各樣的宿主去除（host-depletion）方法。已發(fā)表的和商業(yè)的方案已經(jīng)使得從哺乳動(dòng)物源液體樣本中進(jìn)行長(zhǎng)讀序測(cè)序和細(xì)菌MAG構(gòu)建成為可能。盡管一些方案已經(jīng)使用固態(tài)組織類型的樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，而其他方案可能在這些樣本中有成功的案例，但沒有任何一個(gè)方案被證明能足夠有效的從固態(tài)哺乳動(dòng)物組織中構(gòu)建細(xì)菌MAG。此外，許多宿主去除的方法由于處理時(shí)間過長(zhǎng)和方案復(fù)雜而不適用于臨床操作。

該研究開發(fā)和優(yōu)化了一個(gè)微生物富集方法（MEM），以從復(fù)雜樣本中去除宿主核酸，而不大幅度擾亂微生物群落的組成。研究人員在實(shí)驗(yàn)室和臨床環(huán)境中展示了MEM的性能，包括唾液、糞便、腸道刮片和腸道活檢在內(nèi)的各種樣本類型。還展示了MEM后續(xù)的宏基因組測(cè)序在沿著胃腸道的人類腸活檢中檢測(cè)高豐度和低豐度微生物分類群、代謝通路和基因的能力。此外，研究人員還對(duì)使用MEM直接從人類腸活檢中構(gòu)建MAG，以識(shí)別和區(qū)分亞種群和亞種群變種優(yōu)異性能進(jìn)行了展示。

MEM minimizes loss of bacteria during sample processing

MEM通過利用宿主細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞之間的大小差異，結(jié)合了使用機(jī)械壓力（bead beating）的選擇性裂解方案從而選擇性的裂解宿主細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞（Fig.1a,b）。通常用于微生物裂解的珠子大小為0.1-0.5mm，我們選用更大的珠子（1.4mm）裂解更大的宿主細(xì)胞同時(shí)保持小的細(xì)菌細(xì)胞完整性。隨后添加核酸酶降解胞外核酸和裂解死亡的微生物核酸。蛋白酶K進(jìn)一步裂解宿主細(xì)胞并降解宿主組蛋白以釋放DNA。研究人員還測(cè)試和優(yōu)化了影響MEM性能的其他因素，包括酶解法去除核酸，珠磨法和不同孵育時(shí)間，使整個(gè)方案保持在20 min以內(nèi)，并在溫和的處理?xiàng)l件下防止微生物裂解。為了比較MEM與現(xiàn)有的去宿主方法，我們選擇了三種已發(fā)表的不同細(xì)胞裂解方法:MolYsis, QIAamp和lyPMA。所有的去宿主方法包括兩個(gè)主要步驟:選擇性裂解，然后是核酸去除。QIAamp通過一種弱清潔劑(皂苷)來裂解缺乏細(xì)胞壁的細(xì)胞。MolYsis通過暴露于低濃度的胍鹽來選擇性裂解更脆弱的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。lyPMA通過滲透裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并利用光化學(xué)使DNA結(jié)合單疊氮丙啶(PMA)使其不能被擴(kuò)增。

為了量化MEM如何影響微生物群落的組成和單個(gè)分類群的相對(duì)豐度，我們首先使用冷凍小鼠糞便樣本。我們選擇糞便樣本而不是人工合成菌群來表征微生物對(duì)一系列獨(dú)特分類群和連續(xù)豐度的影響。這是因?yàn)?strong style="box-sizing: border-box;">小鼠糞便樣本通常不需要去除宿主，因?yàn)樗鼈兊乃拗魑廴据^低(超過90%的DNA來自非宿主細(xì)胞)。微生物細(xì)胞的高含量使糞便成為表征不同去宿主方法對(duì)微生物群落組成影響的理想材料。此外，由于提取試劑盒效率的變化，仍需人工合成菌群作為DNA提取的對(duì)照樣品。

雖然無法提取樣品中的所有DNA，但所有樣品去宿主后都使用相同的提取試劑盒處理以標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒和/或裂解效率。在均質(zhì)糞便樣本，我們觀察到五種去宿主方法與對(duì)照組未經(jīng)處理的樣品相比均有類似的微生物損耗(圖1c)。MEM產(chǎn)生了平均31%(+11%; standard deviation)的細(xì)菌損耗，而其在糞便中10%至50%的死亡微生物細(xì)胞的預(yù)期比例范圍內(nèi)。為比較MEM和其他去宿主方法對(duì)微生物組分類水平上的影響，研究人員對(duì)小鼠糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA基因的定量分析。通過比較，作者發(fā)現(xiàn)lyPMA和QIAamp方法對(duì)細(xì)菌總量損耗最大，而MolYsis和QIAamp的細(xì)菌損耗最不均勻，一些分類群下降超過100倍(圖1c,d)。先前的研究建議QIAamp可以降低皂苷的濃度來減少這些細(xì)菌的損耗。作者證實(shí)，MEM微生物群落損耗最小;超過90%的屬的相對(duì)豐度差異在MEM與對(duì)照樣品中無顯著性。此外，所有檢測(cè)到的分類群與對(duì)照樣品中一致而MolYsis和QIAamp則有缺失(附表1)。因?yàn)镸EM選擇性裂解是根據(jù)宿主細(xì)胞的細(xì)胞大小，而化學(xué)裂解的裂解程度可能根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁和/或膜結(jié)構(gòu)的不同而不同，因此，MEM與化學(xué)裂解(MolYsis和QIAamp)相比能引起更低的細(xì)菌偏好。

為確定MEM和其他方法的去宿主效率，作者對(duì)三種類型的樣品(液體、軟組織、實(shí)體組織)定量了宿主含量 (Fig.1e-g)，其中實(shí)體組織宿主DNA占總量的99.9%。在唾液樣本中都能一定程度上的減少宿主。經(jīng)MEM處理后，宿主減少超過40倍(圖1e)。由于唾液黏蛋白含量高而添加的二硫索糖醇(DTT)預(yù)處理略微增加了MEM對(duì)宿主的去除(圖1e和附圖3)。lyPMA在去除宿主方面表現(xiàn)得非常有效，但難以高效地使用，因?yàn)樵摲椒ǖ幕瘜W(xué)計(jì)量學(xué)性質(zhì)在宿主水平低于預(yù)期時(shí)可能導(dǎo)致大量微生物損失(附圖3)。此外，MolYsis顯示出細(xì)菌回收率增加?？赡苁怯捎陬~外的突變裂解步驟造成的。

之后，作者檢查了整個(gè)組織樣本的去宿主，從上皮層的小鼠腸道刮樣開始分離黏膜相關(guān)細(xì)菌(附圖4)。MEM和一些已發(fā)表的方法均有效地去除了刮削樣品中的宿主污染 (圖1f)。MEM, MolYsis和QIAamp都顯示出了約1000倍的宿主去除率(MEM平均消耗1600倍±170)，其中，QIAamp表現(xiàn)出來了略大的宿主去除效果。lyPMA在軟組織樣品上表現(xiàn)不佳，因?yàn)樵摲椒ㄒ蕾囉谧贤饩€激活的交聯(lián)，使其與不透明類型樣品不兼容。

接下來，作者利用在解剖學(xué)上和人體腸道活檢較為相似的硬組織樣本大鼠結(jié)腸切片上測(cè)試了去宿主方法。由于lyPMA在軟組織上的表現(xiàn)不佳，因此本實(shí)驗(yàn)中作者將其在硬組織實(shí)驗(yàn)中被去除(圖1f)。研究發(fā)現(xiàn)，MEM是唯一對(duì)固體組織樣本有效的方法(圖1 g)。MEM的處理幾乎能夠完全去除宿主DNA(去除3600倍，s.d 1500)，而MolYsis和QIAamp處理后的宿主DNA水平與對(duì)照組相似。

這些實(shí)驗(yàn)證明MEM適用于固體組織，可以將宿主DNA去除1000倍以上同時(shí)使微生物相對(duì)豐度的損失降到最低。在實(shí)驗(yàn)中，MEM處理和對(duì)照樣品的16s相對(duì)豐度在超過90%的屬中無顯著差異。

Shotgun sequencing of MEM-treated saliva and stool

隨后，作者研究了MEM在宏基因組學(xué)中的應(yīng)用。由于生物量的限制，通過對(duì)對(duì)照(非宿主去除)樣本進(jìn)行隨機(jī)法測(cè)序來準(zhǔn)確表征微生物群落在腸道活檢中是不可實(shí)現(xiàn)的。因此，首先使用了唾液和糞便樣本來調(diào)查微生物組中與MEM處理相關(guān)的潛在偏差。作者首先證實(shí)了MEM處理能夠可靠地減少小鼠糞便和人類唾液樣本中的宿主序列(圖2a,c)。DTT在唾液中的預(yù)處理使宿主去除效果提高了大約10倍(圖2c)。

接下來，研究人員比較了對(duì)照組和MEM處理的樣品測(cè)序結(jié)果。糞便和唾液中細(xì)菌類群的相對(duì)豐度與對(duì)照組的相對(duì)豐度呈高度相關(guān)(Pearson測(cè)定系數(shù)，糞便中的R² = 0.93，唾液中MEM和MEM + DTT的R² = 0.90；相對(duì)豐度在0.1%以上的分類群R² = 0.93)。對(duì)于糞便和唾液樣品，對(duì)照與MEM處理樣品中的物種相對(duì)豐度之間的高度相關(guān)性表明，MEM并沒有實(shí)質(zhì)性地改變微生物組的組成(圖2b、d和附表2、3)。對(duì)于唾液樣品，低豐度類群與MEM樣本中特定物種富集之間的相關(guān)性則不顯著，通過比較低豐度物種的跨樣本變異系數(shù)，可以更定量地進(jìn)行研究(圖2e)。MEM處理的唾液樣本具有較低的變異系數(shù)(50%變異系數(shù)，95%置信區(qū)間)，表明與未處理的對(duì)照組相比具有更好的可重復(fù)性。此外，MEM提高了低豐度物種的定量(相對(duì)豐度為0.05-0.5%)，可以檢測(cè)到在唾液中未檢測(cè)到的另外10種物種。研究人員進(jìn)一步證實(shí)，這些分類群不是在MEM處理過程中引入的(附圖5)。這些用小鼠糞便和人類唾液樣本進(jìn)行的測(cè)序?qū)嶒?yàn)表明，MEM處理引入了最小的微生物偏差(超過98%的微生物物種的相對(duì)豐度損失不到四倍)，同時(shí)在相同的測(cè)序深度檢測(cè)到了額外的微生物分類群。

圖2. 隨機(jī)法測(cè)序證實(shí)MEM去除宿主后糞便和唾液的微生物富集。

a、通過與小鼠參考基因組比對(duì)，以生物信息學(xué)方法計(jì)算對(duì)照組和經(jīng)MEM處理的小鼠糞便樣本中非宿主讀序的百分比。

b、在對(duì)照和MEM處理的小鼠糞便中繪制種相對(duì)豐度，并覆蓋在顯示1:1的相關(guān)性虛線上。

c、對(duì)照組和經(jīng)MEM處理的新鮮人唾液進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序。通過與人類參考基因組比對(duì)，以生物信息學(xué)方法計(jì)算非宿主讀序的百分比。一份唾液樣本被平均分成九種方式進(jìn)行比較。

d、繪制了對(duì)照和MEM處理過的新鮮人唾液種水平分類群的相對(duì)豐度圖，并覆蓋在一個(gè)虛線上顯示1:1相關(guān)性的直線。經(jīng)MEM處理前進(jìn)行了額外的DTT預(yù)處理的樣本(MEM + DTT) 。

e、變異系數(shù)(CV)根據(jù)相對(duì)物種豐度繪制，并根據(jù)檢測(cè)到的分類群的處理類型著色。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)物種;灰色、深藍(lán)色和淺藍(lán)色點(diǎn)表示三種處理(對(duì)照、MEM和MEM + DTT)中均存在的分類群。MEM/MEM + DTT only(紅點(diǎn))表示僅在MEM處理樣品中發(fā)現(xiàn)的10個(gè)分類群。僅對(duì)照(橙色點(diǎn))表示僅在對(duì)照樣本中發(fā)現(xiàn)的單一分類群，經(jīng)鑒定為嗜血桿菌。

MEM feasibility on human intestinal mucosal biopsies

為了確定MEM在人體腸道活檢中的表現(xiàn)，我們招募了通過結(jié)腸鏡檢查進(jìn)行常規(guī)結(jié)腸癌篩查的健康參與者。從4名參與者中，我們分別進(jìn)行了8次黏膜活檢;每位參與者的4個(gè)活檢組織用于MEM的處理組和4個(gè)作為未處理的對(duì)照組(圖3a)。由于擔(dān)心低細(xì)菌載量樣品中的污染DNA，我們還通過對(duì)MEM處理的空白進(jìn)行定量16S rRNA基因測(cè)序，表征了與MEM相關(guān)的背景細(xì)菌信號(hào)和我們的處理方法(方法和附表4和5)。在所有16次活檢中，MEM去除了2000多倍的宿主DNA，大多數(shù)活檢的宿主水平與MEM處理后的空白相當(dāng)(圖3b)。

為了確定MEM如何在群落水平上影響人類腸道微生物組，我們首先進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序。在計(jì)算去除空白中絕對(duì)豐度較高的類群后，大約93%的屬保留在了MEM處理和對(duì)照活組織檢查中，這使我們相信大多數(shù)檢測(cè)到的類群不是背景污染物。為了進(jìn)一步證實(shí)MEM沒有引入額外的污染，我們發(fā)現(xiàn)MEM和對(duì)照活組織檢查的分類群豐度之間存在強(qiáng)烈的一致性(附表6)。測(cè)序結(jié)果的主成分分析表明，MEM引入的微生物相對(duì)豐度的任何差異都小于參與者之間觀察到的差異(圖3c)。測(cè)序結(jié)果分析顯示，MEM處理后大多數(shù)類群的相對(duì)豐度變化很小，約88%的類群相對(duì)豐度與對(duì)照組沒有顯著差異(Mann-Whitney u檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)P = 0.05)。在相對(duì)豐度大于1%的分類群中，95%以上的分類群在MEM和對(duì)照樣品之間無顯著差異。對(duì)照組和MEM處理組之間分類群的log2倍差異接近正態(tài)分布(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量為0.074,P = 0.11)(圖3d)。此外，對(duì)照和MEM處理的樣品之間的相對(duì)分類群豐度呈線性相關(guān)(圖3e)。當(dāng)在臨床人體腸道活檢環(huán)境中使用時(shí)，MEM能夠去除超1000倍以上的宿主污染，同時(shí)在微生物相對(duì)豐度方面引入的偏差也最小。

圖3 使用和不使用MEM處理的成對(duì)人腸道活檢樣品中的微生物富集分析。

a、樣品采集說明。

b、使用單拷貝宿主引物的ddPCR對(duì)每次活檢的宿主DNA進(jìn)行定量。人類基因組剩余量是指該單拷貝基因在1μl洗脫液中存在的豐度(*表示測(cè)量值低于空白，LoB的限制)。

c、活檢采用16S rRNA基因測(cè)序和微生物屬水平相對(duì)豐度主成分分析(PCA)來觀察微生物種群變化。

d、用黑色覆蓋的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布繪制了對(duì)照和MEM處理的活組織之間微生物屬水平相對(duì)豐度的log2倍差異。

e、在對(duì)照和MEM處理的活組織中測(cè)量的微生物屬水平的相對(duì)豐度被繪制并覆蓋在虛線上，顯示1:1的相關(guān)性?；疑怀鲲@示的是低于定量限(LOQ)的分類群。橙色突出顯示的分類群在對(duì)照和MEM活檢之間的變化大于4倍.

MEM enables study of microbial species, pathways and genes

為了研究MEM是否能夠從人類腸道活檢組織中檢測(cè)和表征額外的微生物物種、功能代謝通路和基因，我們對(duì)來自CT18及其相對(duì)應(yīng)的對(duì)照和MEM處理的活檢組織進(jìn)行了隨機(jī)宏基因組測(cè)序，深度超過1億讀序(每種條件n = 2)(圖3a)。研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照樣品相比，MEM處理的樣品中檢測(cè)到的生物體數(shù)量增加了大約100倍，相關(guān)功能代謝通路數(shù)量增加了700倍，基因數(shù)量增加了400倍以上(圖4a)。當(dāng)只比較完整通路(定義為90%以上完成)時(shí)，在對(duì)照活檢中均未檢測(cè)到完整通路。對(duì)照組平均檢測(cè)到1.5(±1.5)個(gè)物種和728(±107)個(gè)基因，而MEM組平均檢測(cè)到137.5(±21.5)個(gè)物種和300,641(±6,922)個(gè)基因。MEM處理使宏基因測(cè)序?qū)?strong style="box-sizing: border-box;">微生物的分類降低到相對(duì)豐度0.005%，而在對(duì)照活檢中，檢測(cè)類似測(cè)序深度的微生物需要最低10%的相對(duì)豐度。MEM處理的活組織可以檢測(cè)到相對(duì)豐度為10^?10的基因，而在對(duì)照活組織中，基因只能在最小相對(duì)豐度為10^?5時(shí)被檢測(cè)到。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MEM處理提高了檢測(cè)最豐富基因的再現(xiàn)性。我們比較了兩個(gè)MEM處理和兩個(gè)對(duì)照活檢中最豐富的前5000個(gè)基因的相對(duì)豐度(圖4b)。在對(duì)照活組織檢查中，僅在一個(gè)樣本中檢測(cè)到高比例的基因(98%)，而對(duì)于MEM處理的樣本，僅在一個(gè)生物學(xué)重復(fù)中檢測(cè)到3%的基因，而在另一個(gè)生物學(xué)重復(fù)中未檢測(cè)到。

隨后，我們測(cè)試了MEM是否能夠在個(gè)體之間橫向和縱向上跨越單個(gè)個(gè)體的胃腸道來表征微生物變異(在分類群、通路和基因水平上)。5名接受結(jié)腸鏡檢查的健康參與者分別在胃腸道的四個(gè)區(qū)域采樣:回腸末端、升結(jié)腸、降結(jié)腸和直腸。在每個(gè)位置進(jìn)行了3次活檢，每位參與者總共進(jìn)行了12次活檢(圖4c)。所有活組織切片均采用MEM處理，并通過16S rRNA基因測(cè)序和宏基因組測(cè)序?qū)ξ⑸锓诸悊卧M(jìn)行表征，平均測(cè)序讀序深度為2500萬，平均產(chǎn)生200萬非宿主讀序(圖4d-f和附圖1和圖2)。所鑒定的187種微生物中約有一半是單個(gè)個(gè)體所特有的(圖4d和附表7)。這些獨(dú)特物種的相對(duì)豐度范圍為10%至0.01%(附圖6)。正如之前觀察到的，與物種分類(屬和種)相比，參與者之間的通路似乎更為保守。

圖4 經(jīng)MEM處理的人類腸道活檢的宏基因組測(cè)序。

a、對(duì)參與者CT18(兩個(gè)MEM處理和兩個(gè)對(duì)照) 的四個(gè)活檢組織進(jìn)行隨機(jī)法測(cè)序，并繪制每個(gè)樣本中鑒定的微生物種類，通路和基因的數(shù)量(n = 2)。

b，對(duì)于前5000個(gè)豐度最高的基因，繪制了兩個(gè)MEM處理的活檢組織與兩個(gè)對(duì)照活檢組織之間相對(duì)豐度的log2倍變化。

c、抽樣采集示意圖。比例尺（Scale bar），5厘米。

d、屬、種、功能代謝通路和基因的特征數(shù)量根據(jù)它們是否存在于至少一個(gè)活檢樣本中，來自一個(gè)參與者，兩個(gè)參與者，三個(gè)參與者，四個(gè)參與者或來自所有五個(gè)參與者。

e,f、主成分分析(PCA)對(duì)所有60個(gè)縱向樣本按參與者分組。

e、16S rRNA基因測(cè)序?qū)偌?jí)別相對(duì)豐度的主成分分析。f、隨機(jī)法測(cè)序物種相對(duì)豐度的主成分分析。

Variation in mucosal microbes longitudinally in the GI tract

由于可以從黏膜活檢中獲得的微生物讀序較少，因此很難確定黏膜相關(guān)微生物在胃腸道中是否存在差異。本研究中，研究人員首先測(cè)試了胃腸道部位之間的微生物差異是否存在于屬水平上。對(duì)于每個(gè)參與者樣本，本研究使用定量16S rRNA基因測(cè)序來量化沿胃腸道縱向的屬水平微生物變化。在大多數(shù)參與者中，近端結(jié)腸(末端回腸和升結(jié)腸)和遠(yuǎn)端結(jié)腸(降結(jié)腸和直腸)的微生物類群在空間位置上表現(xiàn)出一定的聚集性(圖4e)。對(duì)每個(gè)參與者樣本進(jìn)行隨機(jī)宏基因組測(cè)序，以測(cè)試觀察到的胃腸道分類群差異是否延伸到物種、通路或基因水平。在一些跨物種的參與者中，即參與者CT7、CT12、CT13和CT14中，可以看到回腸末端和升結(jié)腸與降結(jié)腸和直腸之間的聚類(圖4f)。在通路和基因水平上，回腸末端和升結(jié)腸與降結(jié)腸和直腸之間似乎存在最小的聚類(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3)。此外，某些個(gè)體在區(qū)域內(nèi)存在很大差異，這可能歸因于測(cè)序深度的限制。例如，對(duì)于CT13的一個(gè)降結(jié)腸樣本，由于非宿主讀序的數(shù)量最少，沒有鑒定出微生物標(biāo)記基因(圖4f)。

對(duì)經(jīng)過MEM處理的人類腸道活組織進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序，可以表征高豐度和低豐度的微生物物種、通路和基因。這一特征記錄了沿著人類下消化道黏膜微生物組的縱向變化。為了研究單一微生物菌株是否沿著胃腸道變化，本研究也嘗試了從MEM處理的腸道活檢中組裝微生物基因組。

MEM enables MAG of intestinal microbes from human biopsies

為了確定MEM處理后是否可以構(gòu)建MAG，本研究從參與者CT18中選擇了兩個(gè)具有相似細(xì)菌載量的對(duì)照和兩個(gè)MEM處理的活組織切片(圖3a和4a)。如前所述，對(duì)樣本進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序和基因組組裝處理。本研究對(duì)對(duì)照和MEM處理的活組織切片進(jìn)行了測(cè)序，以測(cè)量MEM處理在相同測(cè)序深度下是否能夠有助于挖掘出更多信息。處理后，從生物信息學(xué)上去除宿主序列，在MEM處理的樣本中，大約10%的測(cè)序讀序被鑒定為非宿主，而在未經(jīng)處理的對(duì)照組中，僅有大約0.01%的測(cè)序讀序被鑒定為非宿主(圖5a)。

本研究首先試圖從對(duì)照樣本中重建MAGs，然而，從非宿主去除的樣本中組裝短讀序序列，以及我們隨后試圖將所得重疊群放入MAGs的嘗試都沒有成功，因?yàn)檫@些組裝受到了非常短的重疊群的影響(圖5b)。然后對(duì)MEM處理過的樣品進(jìn)行共組裝，與對(duì)照樣品相比，獲得了更多更長(zhǎng)的重疊群, 重疊群長(zhǎng)度可達(dá)833 kbp(圖5b和附表8)。自動(dòng)分箱和手動(dòng)優(yōu)化步驟共產(chǎn)生了34個(gè)高質(zhì)量的細(xì)菌MAGs(超過90%完成，少于5%冗余)和70多個(gè)中等質(zhì)量的MAGs(超過50%完成，少于10%冗余)。展示了MEM對(duì)人類腸道活檢的處理如何使從這些樣本中重建MAG成為可能。對(duì)于34個(gè)高質(zhì)量的MAG，我們計(jì)算了檢測(cè)結(jié)果，它報(bào)告了給定參考序列中被給定宏基因組中至少一個(gè)短讀序列的核苷酸的比例。因此，檢測(cè)是一種非常有效的方法，能夠討論給定樣本中給定種群的存在，獨(dú)立于序列覆蓋率，并通過避免由于非特異性序列招募而產(chǎn)生的假陽性。為了確認(rèn)從MEM處理過的樣本重建的MAG是未經(jīng)處理的活檢樣品中真實(shí)存在的MAG，作者評(píng)估了比對(duì)回MAG時(shí)對(duì)照序列覆蓋率的均勻性(圖5c)。為了進(jìn)行這一分析，作者選擇了一種MAG，可以分辨出在對(duì)照樣品中檢測(cè)到最高的已知腸道微生物。對(duì)照樣本顯示，29個(gè)重疊群的讀序分布均勻，表明該MAG也存在于對(duì)照樣本中，但測(cè)序深度的限制阻礙了基因組的重建?？偟膩碚f，我們觀察到，與對(duì)照樣品相比，MEM處理樣品中所有34種高質(zhì)量MAG的檢出率更高(圖5d)。

為了量化來自對(duì)照樣本的測(cè)序序列是否比對(duì)回了所有34個(gè)高質(zhì)量MAG，本研究也繪制了每個(gè)MAG的檢測(cè)圖(圖5d)。接下來，為了評(píng)估這些MAG是否受到污染，研究人員對(duì)每個(gè)基因組進(jìn)行了分類。在95%的平均核苷酸一致性(ANI)閾值下，33個(gè)MAG被成功分類。研究人員也將每個(gè)分類MAG的大小與基因組分類數(shù)據(jù)庫(GTDB)中匹配的參考基因組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與當(dāng)前微生物數(shù)據(jù)庫高度一致(R² = 0.78, P = 4.32 × 10^?12)，表明由MEM處理的樣品構(gòu)建的MAG不是人工產(chǎn)物(附表9和10)。一個(gè)梭桿菌MAG與已發(fā)表的糞便來源的MAG在86.85%的ANI上非常匹配，但GTDB無法分配物種水平的分類(附圖7)。因?yàn)樗械腗AG都是以相同的方式構(gòu)建的，并且具有相似的質(zhì)量指標(biāo)，所以這個(gè)梭桿菌MAG很可能是一個(gè)未表征的分類單元，而不是污染。我們還想量化我們可以用MAG捕獲的微生物多樣性的范圍。這34個(gè)MAG跨越了6個(gè)細(xì)菌門(圖5d)，從參與者CT12構(gòu)建了一個(gè)古菌(Methanobrevibacter smithii))MAG，表明MEM處理的活組織檢查能夠重建古菌和各種細(xì)菌的基因組(附圖4)。使用MEM，從人類腸道活組織檢查的微生物中重建了高質(zhì)量的微生物MAG，相對(duì)豐度低至1%。

圖5 通過宏基因組測(cè)序?qū)?jīng)MEM處理的人腸道活檢進(jìn)行MAG構(gòu)建。

a、對(duì)來自同一參與者(CT18)和腸道區(qū)域(升結(jié)腸)的兩個(gè)對(duì)照和兩個(gè)MEM處理的活檢樣品進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序。在與人類參考基因組比對(duì)后確定非宿主讀序的數(shù)量。

b、將每個(gè)條件下的兩個(gè)樣本聚類構(gòu)建重疊群，并繪制重疊群長(zhǎng)度的分布圖。顯示了在這些組合中鑒定的原核基因的數(shù)量。

c、Alistipes putredinis的MAG是由共同組裝的MEM活檢構(gòu)建的。條形圖的高度表示平均覆蓋率，并對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行獨(dú)立縮放。

d、從MEM活檢的集合中，重新構(gòu)建了34個(gè)高質(zhì)量的MAG(超過90%完成，少于5%冗余)。熱圖顯示了每個(gè)基因組至少被樣本覆蓋一次的百分比(即檢測(cè)或呼吸覆蓋)，在對(duì)照樣本中最大為3.7%，在MEM樣本中最大為99.999%。在所有MAG中，MEM1、MEM2、Cntrl1和Cntrl2的平均檢出率分別為97.3% (s.d 6.4%)、99.8% (s.d 0.7%)、1.2% (s.d 1.1%)和0.8% (s.d 0.7%)。對(duì)每個(gè)MAG進(jìn)行分類，并在右側(cè)列出完成度和冗余度(C/R)。系統(tǒng)發(fā)育樹熱圖的左側(cè)突出顯示了每個(gè)MAG的分類分組。

MEM identifies distinct microbial strains across individuals

在確定直接從人類腸道活檢中構(gòu)建MAG的可行性之后，我們接下來研究了微生物基因組在個(gè)體之間和個(gè)體內(nèi)部的差異。為了確定MEM是否能夠區(qū)分單個(gè)分類單元內(nèi)個(gè)體之間微生物的群體水平差異，研究人員對(duì)來自參與者CT12的6份活組織標(biāo)本進(jìn)行了重新測(cè)序，測(cè)序深度約為2.5億讀序。分別對(duì)六個(gè)活檢組織中的每一個(gè)進(jìn)行組裝和分組，并在樣本中重復(fù)MAG。從參與者CT12構(gòu)建并注釋了在所有參與者中發(fā)現(xiàn)的最普遍和最豐富的Phocaeicola vulgatus物種的MAG (圖6a)。然后，從所有五名參與者身上提取的60份腸道活組織檢查的序列比對(duì)到該MAG上，以確定其他參與者的活檢中缺少哪些基因。

如前所述，通過宏基因組序列對(duì)自然發(fā)生的P. vulgatus種群進(jìn)行了基因水平上的解析分析，并揭示了一個(gè)大的核心基因組和個(gè)體間差異發(fā)生的基因(圖6a)。來自參與者CT12胃腸道區(qū)域活檢的基因似乎是保守的(CT12樣本的平均基因檢出率超過96%)。一些高檢測(cè)基因僅在一個(gè)或兩個(gè)參與者(CT12或CT12和另一個(gè)參與者)中發(fā)現(xiàn)，我們將其定義為獨(dú)特基因。為了評(píng)估這些基因是否在功能上不同，我們用COG數(shù)據(jù)庫對(duì)基因進(jìn)行了注釋，以確定同源基因。在CT12特有的287個(gè)基因中，其中100個(gè)基因被COG注釋，并對(duì)應(yīng)于廣泛的功能(附圖8)。在兩個(gè)參與者(即CT12和另一個(gè)個(gè)體)特有的基因簇中，約30%被注釋(附圖8)。MEM處理可以深入了解具有相似健康狀況的個(gè)體在腸道中占據(jù)相同空間位置的同一分類單元的功能不同的微生物種群。

SNVs detectable across GI tract regions within an individual

最后，本研究研究了MEM處理是否可以通過增加覆蓋深度，通過單核苷酸變異(SNVs)研究低生物量樣品中的微生物種群遺傳學(xué)。在這項(xiàng)分析中，該研究分析了來自參與者CT12的MAGs作為參考基因組，并將來自CT12的回腸末端和降結(jié)腸的成對(duì)末端讀序比對(duì)到這些組裝的基因組上。在所有6個(gè)樣本(3個(gè)回腸末端和3個(gè)降結(jié)腸)中，6個(gè)MAG的平均覆蓋率超過50倍，并被選中用于后續(xù)的SNV分析(附圖9)。通過將每個(gè)樣本的配對(duì)末端讀序與參考序列(MAG)進(jìn)行比較，生成SNV譜。我們通過為單個(gè)回腸末端活檢的另外三個(gè)技術(shù)重復(fù)準(zhǔn)備文庫(圖6b)，研究了PCR錯(cuò)誤是否可能導(dǎo)致我們數(shù)據(jù)中觀察到一些SNVs，期望技術(shù)重復(fù)的SNV譜差異應(yīng)該是最小的。通過觀察在一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)重復(fù)中發(fā)生的核苷酸變異，我們觀察到Ruminococcus bromii與參考核苷酸的最小偏差為21%(圖6b)，僅允許選擇SNVs，并將群體結(jié)構(gòu)分析中PCR錯(cuò)誤的影響降至最低。利用固定指數(shù)對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，一些分類群，如R. bromii(圖6c)和Gemmiger formicilis(附圖9)，是由上下腸道不同的亞群組成的。為了評(píng)估這些SNVs在功能上是否重要，我們對(duì)R. bromii的SNVs進(jìn)行了密碼子水平和翻譯(氨基酸)分析，并根據(jù)位置檢測(cè)了類似的活檢聚類(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5)。通過更深入的測(cè)序和活檢樣本中MAGs覆蓋率的增加，SNVs的恢復(fù)使我們能夠檢測(cè)單個(gè)個(gè)體下胃腸道中某些個(gè)體分類群的亞群結(jié)構(gòu)的存在。

圖6 沿胃腸道存在的個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)細(xì)菌多樣性。

a，對(duì)所有5名參與者進(jìn)行了P. vulgatus基因水平分析。通過基因檢測(cè)對(duì)樣本進(jìn)行分組，定義為每個(gè)基因的覆蓋率至少為1×coverage的百分比，并顯示出強(qiáng)烈的參與者依賴性分組，但缺乏根據(jù)胃腸道位置進(jìn)行分組。

b、R. bromii MAG中SNVs發(fā)生的經(jīng)驗(yàn)累積分布函數(shù)以及這些SNVs在三個(gè)技術(shù)重復(fù)中與參考值的偏差。1/3、2/3和3/3表示在該位置具有SNV的技術(shù)重復(fù)數(shù)，然后是每個(gè)類別中SNV的總數(shù)。在與參考值偏離21%處繪制黑色虛線;高于此值，所有觀察到的SNVs都存在于所有三個(gè)技術(shù)重復(fù)中。

c，對(duì)所有樣品的平均覆蓋率超過50倍的MAG進(jìn)行核苷酸水平分析。圖中顯示的是在R. bromii的編碼區(qū)域內(nèi)分析的SNVs的固定指數(shù)，與參考集的最小偏差為21%。根據(jù)固定指數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行聚類，可以看到很強(qiáng)的區(qū)域依賴性分組。DC:降結(jié)腸;TI，回腸末端。

MEM適用于富含哺乳動(dòng)物宿主的樣本，它使得對(duì)這些樣本中存在的微生物進(jìn)行宏基因組測(cè)序和分析成為了可能。MEM能夠從固態(tài)哺乳動(dòng)物組織中去除超過1000倍的宿主DNA，并同時(shí)最小化對(duì)微生物群落組成表征的干擾。MEM方法簡(jiǎn)單且快速，處理時(shí)間不到30分鐘，便于集成到實(shí)驗(yàn)室或臨床工作流程中，無需現(xiàn)場(chǎng)培訓(xùn)。MEM與微生物DNA的宏基因組測(cè)序高度兼容，與相似測(cè)序深度的對(duì)照樣本相比，能檢測(cè)到超過400倍的微生物種類和基因，同時(shí)也包括低豐度種類。MEM能夠直接從人類腸道活檢中以低至1%的相對(duì)豐度對(duì)整個(gè)微生物基因組進(jìn)行培養(yǎng)獨(dú)立組裝。MAG的組裝使研究個(gè)體之間和個(gè)體胃腸道內(nèi)的亞群變化成為了可能。

本研究開發(fā)的MEM方法也有以下局限性。研究人員已分析過具有少至10²個(gè)16S rRNA基因拷貝/μl的活檢樣本（相當(dāng)于每毫克組織大約有10⁴個(gè)16S拷貝），但要深入分析這一細(xì)菌載量以下的樣本，需要更大程度的宿主去除率和/或更深的測(cè)序深度。所以研究人員也建議用戶參考附圖1，根據(jù)細(xì)菌載量預(yù)測(cè)非宿主讀序的百分比，以指導(dǎo)測(cè)序的深度。本研究也已成功地將MEM應(yīng)用于了健康的腸道活檢樣品中，但對(duì)于可能干擾分析的特殊樣本，例如有活躍炎癥或出血的樣本，還需要進(jìn)行額外的驗(yàn)證。對(duì)于保存的組織樣本，也需要額外的驗(yàn)證。本研究?jī)H研究了MEM對(duì)細(xì)菌和古菌的影響，未來的研究將揭示MEM是否會(huì)影響真菌組和病毒組。

本研究對(duì)鼠類糞便、腸道刮片、大鼠結(jié)腸部分、人類唾液和人類腸道活檢驗(yàn)證了MEM。為了擴(kuò)展MEM的使用范圍，將來需要對(duì)植物、昆蟲和其他非哺乳動(dòng)物宿主的樣本進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證。使用MEM進(jìn)行樣本處理還將實(shí)現(xiàn)更高的吞吐量和更低成本的微生物組調(diào)查，即使是在宿主含量適中的樣本中。例如，在唾液中，從10%增加到95%的微生物序列可以將測(cè)序成本降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。在臨床研究中，我們預(yù)計(jì)MEM將為研究者研究腫瘤微生物組、黏膜腸道微生物組、腸道微生物的組織移位以及與復(fù)雜免疫疾病、免疫調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)展相關(guān)的組織相關(guān)微生物的作用提供幫助。

Natalie J. Wu-Woods, Jacob T. Barlow, Florian Trigodet, Dustin G. Shaw, Anna E. Romano, Bana Jabri, A. Murat Eren & Rustem F. Ismagilov. (2023). Microbial-enrichment method enables high-throughput metagenomic characterization from host-rich samples. Nature Methods, https://doi.org/10.1038/s41592-023-02025-4