撰文：黃朝 西北大學(xué)
責(zé)編：劉永鑫 中科院遺傳發(fā)育所
微生物無處不在，是具有生態(tài)意義的淡水環(huán)境分類和功能多樣化的組成部分。淡水系統(tǒng)中的細(xì)菌，古細(xì)菌和真核微生物支持一系列生態(tài)過程和功能。然而，我們對微生物生態(tài)學(xué)知之甚少。隨著人類新世紀(jì)的發(fā)展，對淡水的需求隨著人口密度的增加而增加，并且越來越多地受到氣候變化，富營養(yǎng)化和化學(xué)污染等多重且往往相互作用壓力因素的威脅。因此，如果我們要有效地管理淡水環(huán)境的未來，就必須了解微生物的生態(tài)學(xué)及其在淡水生態(tài)系統(tǒng)中的功能作用。為此，研究人員討論了微生物生態(tài)學(xué)分子實驗技術(shù)的歷史，并強調(diào)了這些方法能夠解決問題的范疇。通過最近的一些研究，我們描述了一些淡水系統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)的示例，并強調(diào)分子手段如何提供新的生態(tài)學(xué)見解。最后，我們詳細(xì)介紹了該研究領(lǐng)域的一些有前景的發(fā)展，以及這些發(fā)展如何影響淡水微生物生態(tài)學(xué)的未來研究。
原名：Streams of data from drops of water: 21st century molecular microbial ecology
期刊：Wiley Interdisciplinary Reviews-Water 【IF=3.943】
通訊作者：Dave R. Clark 和Alex J. Dumbrell【英國埃塞克斯大學(xué)】
時間：2018-02-24
DOI：https://doi.org/10.1002/wat2.1280
1 | INTRODUCTION
微生物無處不在，是地球上最多樣化的生物。據(jù)估計，全球有超過1030個微生物，并且有些微生物占據(jù)最初被認(rèn)為沒有生命的棲息地?？梢哉f，微生物在生態(tài)學(xué)上是最重要的生物，已知它們支持一系列生態(tài)過程和功能，同時驅(qū)動主要的生物地球化學(xué)循環(huán)，因而對生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生巨大影響。
淡水生態(tài)系統(tǒng)對人類文明的持久性至關(guān)重要，但對環(huán)境變化最為敏感。此外，作為陸地和海洋環(huán)境之間的管道，上述任何一個生物群落中的環(huán)境變化都可能顯著改變淡水生態(tài)系統(tǒng)。全球人口密度的增加和相關(guān)的環(huán)境變化將對淡水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生潛在的影響。微生物對于生態(tài)學(xué)家來說具有挑戰(zhàn)性，因為他們的研究物種由于體積小，缺乏顯著的形態(tài)特征而難以識別。為了應(yīng)對這些挑戰(zhàn)，已經(jīng)開發(fā)了基于研究大分子的多種分子方法，并且現(xiàn)在常規(guī)應(yīng)用于淡水生態(tài)系統(tǒng)中的微生物生態(tài)學(xué)研究。
最近的進展集中于開發(fā)越來越高分辨率和高通量的方法，為微生物生態(tài)學(xué)家提供了大量的分子技術(shù)工具。然而，對于不熟悉的分子技術(shù)的快速更新，以及分析這些數(shù)據(jù)所需的一系列伴隨的生物信息學(xué)方法，可能令人困惑，需要進一步闡述分析加以理解。
2 | A BRIEF HISTORY OF MICROBIAL ECOLOGY
用于研究微生物多樣性的技術(shù)可分為兩大類：依賴培養(yǎng)(culture-dependent)和與不依賴培養(yǎng)(culture-independent)。17世紀(jì)中期顯微鏡的發(fā)明促進了對先前未見過的微生物世界的首次觀察。此后依賴培養(yǎng)方法迅速發(fā)展，重點是從環(huán)境中分離微生物，在顯微鏡下觀察它們并進行生化實驗。這些方法提供有關(guān)生長速率，代謝途徑，營養(yǎng)需求和最佳生長條件的有價值信息，這些信息不可能從不依賴培養(yǎng)的方法中獲得。因此，培養(yǎng)基培養(yǎng)仍然是微生物學(xué)的重要工具，當(dāng)與不依賴培養(yǎng)的分子方法結(jié)合使用時，可以揭示以前未知微生物的生態(tài)學(xué)。然而，作為一種獨立的方法，培養(yǎng)依賴的應(yīng)用是有限的。通常不可能在實驗室中重建復(fù)雜的自然環(huán)境，并且許多微生物具有高度特異的生長條件。因此，大多數(shù)微生物不易培養(yǎng)，因此，不依賴培養(yǎng)的分子方法是研究環(huán)境微生物群落所必需的。
不依賴培養(yǎng)的技術(shù)不需要從收集的環(huán)境樣品中分離和培養(yǎng)微生物。這些技術(shù)中的大多數(shù)始于分子生物標(biāo)志物的提取，來自所有生物體的基因，基因組，轉(zhuǎn)錄物和轉(zhuǎn)錄組的信息存在于其中?，F(xiàn)在可以將分子技術(shù)應(yīng)用于這些樣品，其選擇主要取決于所研究的問題以及可獲得的時間和資源。通常，這些方法針對DNA，允許研究人員研究樣本的分類學(xué)和功能多樣性，無論DNA是來自死亡，活著，代謝活躍還是休眠的生物?；蛘?，可以使用RNA，更清晰地了解微生物群落的代謝活性成分的分類學(xué)和功能多樣性。
樣品處理的下一步涉及通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增提取的核酸，PCR使得目標(biāo)基因組/轉(zhuǎn)錄組區(qū)域的數(shù)百萬拷貝擴增，以進行后續(xù)分析。擴增子目標(biāo)的選擇完全取決于所研究的問題，這將集中于提供有關(guān)生物進化特性或其功能潛力信息的遺傳標(biāo)記。此外，通過適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計，可以針對特定的微生物類群，使PCR方法成為篩選水樣中病原微生物存在的有效方法。通過實時定量PCR（qPCR）的技術(shù)，可以實現(xiàn)基因拷貝數(shù)在擴增時的定量，從而提供額外的和互補的分類或功能組成信息。
在過去的20年中，測序技術(shù)和計算能力的快速發(fā)展已經(jīng)改變了分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域。雖然使用克隆文庫與第一代測序技術(shù)相結(jié)合只允許少量擴增子以連續(xù)方式測序，但下一代測序（NGS）技術(shù)現(xiàn)在允許數(shù)百萬個擴增子并行測序。宏基因組學(xué)可以用于生物多樣性調(diào)查（圖1）。通過針對特定微生物類群，宏基因組方法在篩選和鑒定特定微生物方面也是有效的，在淡水生態(tài)系統(tǒng)的背景下，這對于監(jiān)測潛在的污染源尤為重要，例如，通過檢測污水中糞便來源的大腸菌群，或檢測環(huán)境微生物群落中的抗生素抗性基因。此外，當(dāng)應(yīng)用于環(huán)境DNA時，可以使用宏基因組來快速確定可能無法觀察到微生物的存在。
圖1. 一些最常用的分子和宏基因組學(xué)方法示意圖，以及它們適合解決的科學(xué)問題。
無論該研究是觀察性的，實驗性的還是常規(guī)的生物監(jiān)測，所有方法都需要從環(huán)境中提取和純化生物分子，例如DNA或RNA。
左邊的方法需要通過PCR擴增特定基因，而右邊的方法不需要靶標(biāo)，在整個核酸庫水平上進行研究。
NGS技術(shù)的出現(xiàn)也使人們能夠輕松獲得不僅PCR擴增子測序的單獨方法，稱為宏基因組學(xué)(metagenomics)。它將包含來自所有物種的基因組DNA，打斷成較小的片段并直接測序（圖1）。通過生物信息學(xué)組裝得到的序列片段，可以獲得較長的序列，如果獲得足夠的序列，甚至可以重建整個基因組。該方法的優(yōu)點是更準(zhǔn)確地鑒定存在的微生物，以及預(yù)測完整功能的能力。通過檢查測序基因組的功能和代謝屬性，群落的概況。另外，宏基因組方法避免了與PCR擴增相關(guān)的已知偏差，包括引物偏好或嵌合體形成。因此，從宏基因組序列數(shù)據(jù)生物信息學(xué)提取系統(tǒng)發(fā)育或功能標(biāo)記基因可提供比遺傳方法更少偏向于調(diào)查微生物多樣性的方法。因此，宏基因組學(xué)作為研究微生物群落生態(tài)學(xué)的許多方面擁有巨大前景。
如前所述，通過檢測RNA而不是DNA，可以采用相同的（宏基因組）方法來量化在給定時間哪些基因被主動表達(dá)（圖1）。因此，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以在給定時刻提供群落的功能和代謝活動的詳細(xì)表達(dá)譜，并且可以用于檢查響應(yīng)于環(huán)境擾動或現(xiàn)有梯度的瞬時變化。在微妙的對比中，宏基因組學(xué)量化了群落的功能和代謝潛力，在更長的時間尺度上整合數(shù)據(jù)。除了這兩種方法之外，通過研究群落內(nèi)存在的蛋白質(zhì)（宏蛋白質(zhì)組學(xué)）和代謝物（宏代謝組學(xué)），替代“組學(xué)”方法可以提供對下一級生物組織的見解。
在過去的十年中，從單一NGS運行中獲得的序列數(shù)量增加了幾個數(shù)量級。從歷史上看，羅氏454焦磷酸測序平臺是分子微生物生態(tài)學(xué)中使用最廣泛的高通量測序技術(shù)，但在2016年已停產(chǎn)。Illumina的MiSeq和HiSeq平臺現(xiàn)在在很大程度上占據(jù)了主導(dǎo)地位，在序列數(shù)量和運行成本方面與其他平臺相比毫不遜色。隨著每次運行數(shù)千至數(shù)百萬甚至數(shù)十億的序列數(shù)據(jù)集的增長，分析分子數(shù)據(jù)集的計算成本也大大增加?，F(xiàn)代序列數(shù)據(jù)集的龐大規(guī)模意味著生物信息學(xué)分析現(xiàn)在最好在高性能計算機上進行，其中大量的硬盤空間和隨機存取存儲器（RAM）使研究人員能夠有效地處理他們的數(shù)據(jù)。此外，通過利用現(xiàn)代計算機處理器中可用的多個計算核心，當(dāng)前的生物信息學(xué)工具能夠通過在核心之間“并行化”某些任務(wù)來顯著加速分析。然而，當(dāng)通過高通量平臺進行分子分析時，充足的計算資源的可用性仍應(yīng)是一個關(guān)鍵考慮因素。這些平臺，加上高性能計算和生物信息學(xué)方法的不斷發(fā)展，意味著分子生態(tài)學(xué)家現(xiàn)在有潛力探索微生物群落的結(jié)構(gòu)和詳細(xì)功能。
3 | CASE STUDIES
3.1 | qPCR—A catastrophic pesticide spill in the river Kennet
圖2. 這里介紹的每個案例研究的圖形摘要。（a）Thompson等人（2016）使用opd基因的qPCR分析表明相對于對照沉積物，污染沉積物中農(nóng)藥降解微生物的豐度增加了7倍。
在水生系統(tǒng)中，微生物構(gòu)成食物網(wǎng)的基礎(chǔ)，并且通常在環(huán)境擾動中表現(xiàn)出快速變化。因此，了解微生物群落如何應(yīng)對環(huán)境變化，可以闡明生態(tài)影響如何通過食物網(wǎng)傳播，同時提供有關(guān)微生物群落本身功能變化的信息。例如，, Thompson等人（2016）證明了應(yīng)對肯尼特河（英國）內(nèi)突然和災(zāi)難性的農(nóng)藥泄漏而導(dǎo)致的微生態(tài)變化。2013年夏天，在Kennet河內(nèi)發(fā)現(xiàn)了殺蟲劑的災(zāi)難性泄漏，摧毀了15公里長的河流中的所有無脊椎動物的生命。通過采集微生物群落，以及無脊椎動物和其他大型動物，Thompson等人試圖從生物組織的各個層面（從基因到整個生態(tài)系統(tǒng)）了解這種泄漏的潛在影響。qPCR對污染事件上游和下游微生物群落的分析表明，農(nóng)藥對微生物有直接和間接的影響。通過量化有機磷水解酶基因豐度的變化（opd;參與殺蟲劑的降解）（圖2a），Thompson等人表明，在泄漏后，能夠降解農(nóng)藥的細(xì)菌增加了7倍。氨單氧化酶基因（amoA，參與氨的氧化）的定量揭示了氨氧化微生物的豐度（約30倍）的甚至更大的變化。作者將此歸因于腐爛的無脊椎動物的質(zhì)量增加，這將導(dǎo)致氨濃度增加。因此，通過靶向這兩個微生物功能群，作者能夠檢驗殺蟲劑對微生物群落的直接和間接影響；并為觀察到的生態(tài)系統(tǒng)功能變化提供解釋[1]。
3.2 | Metagenetics—Anammox as an important nitrogen loss pathway in freshwaters
（b）Lansdown等人（2016）對來自不同基礎(chǔ)地質(zhì)的河床沉積物的厭氧氨氧化（hzo）基因進行了測序。他們發(fā)現(xiàn)了四種不同的厭氧氨氧化細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育分支，它們在不同的河床地質(zhì)中的相對豐度明顯不同。
NGS方法也有助于揭示淡水微生物群落中各種功能和代謝途徑的存在。例如，Lansdown等人（2016）研究了氮氣產(chǎn)生的替代途徑 - 厭氧氨氧化(anammox) - 已知其在海洋環(huán)境中很重要，但在淡水中相對沒有得到充分研究。厭氧氨氧化是在沒有氧氣的情況下將氨轉(zhuǎn)化為氮氣而不進行反硝化和硝化的過程，這些過程代表了典型的氮循環(huán)。以前，該過程被認(rèn)為發(fā)生在僅限于厭氧條件占主導(dǎo)地位的深海沉積物，直到最近才在淡水中觀察到這一過程。
Lansdown等人試圖了解淡水流的基礎(chǔ)地質(zhì)是否影響厭氧氨氧化，以及厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度和活動是如何支撐的。他們使用擴增子測序（圖2b）研究了源自三種不同地質(zhì)類型的沉積微生物 - 白堊，綠砂和粘土。在16S rRNA基因擴增子中未檢測到已知的厭氧氨氧化細(xì)菌屬，表明它們與其他細(xì)菌類群相比相對較少。然而，肼氧化還原酶基因（hzo; 厭氧氨氧化所需）的擴增子測序顯示存在四種不同的厭氧氨氧化細(xì)菌進化分枝，其在不同的地質(zhì)過程中相對豐度發(fā)生變化（圖2b）。這些結(jié)果支持厭氧氨氧化過程速率的測量，并揭示厭氧氨氧化物是白堊地質(zhì)中氮氣損失的主要途徑[2]。
3.3 | Metatranscriptomics—Diel functional diversity of freshwater microbes
（c）Vila-Costa（2013）在進行了湖泊浮游生物的宏轉(zhuǎn)錄組測序， 他們發(fā)現(xiàn)磷酸鹽攝取基因根據(jù)磷酸鹽來源和一天中的時間差異表達(dá)。
盡管宏基因組學(xué)具有很高的信息量，但通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法可以更好地回答解決大規(guī)模微生物功能多樣性模式的研究問題。例如，Vila-Costa等人（2013年）通過對Llebreta湖的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，提供了對生態(tài)策略中吸收和代謝必需營養(yǎng)磷（P）以及其他關(guān)鍵功能的綜合評估。該淡水湖位于西班牙。他們檢測到白天相對于夜間光合異養(yǎng)過程的基因表達(dá)增加，以及與無機磷攝取相關(guān)的更高基因表達(dá)（圖2c）。在夜間相反，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)增加參與有機磷攝取和代謝的基因（圖2c），從而表明在24小時內(nèi)細(xì)菌P代謝的不同生態(tài)策略。此外，無論采樣時間如何，屬于細(xì)菌類的擬桿菌綱（Bacteroidetes）和β-變形菌綱（Betaproteobacteria）的轉(zhuǎn)錄本都是最豐富的，提供了對活躍的淡水細(xì)菌群落的概況的描述[3]。目前，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)的局限性可能是特定蛋白質(zhì)的低注釋和描述，特別是在淡水微生物群落中。這主要是由于淡水參考數(shù)據(jù)庫的稀缺，需要大量研究人員進行研究，但隨著該領(lǐng)域的不斷發(fā)展，無疑將會做的更好。
4 | THE FUTURE OF MOLECULAR MICROBIAL ECOLOGY
在過去二十年中，DNA / RNA測序技術(shù)的發(fā)展異常迅速。例如，如前所述，羅氏的454焦磷酸測序儀 - 一種用于許多早期NGS研究的高通量測序平臺 - 僅在使用十年后就停產(chǎn)了；被更便宜、更新的NGS平臺取代。在這里，我們重點介紹一些可能在未來幾年推動該領(lǐng)域發(fā)展的最有希望的發(fā)展技術(shù)。分子工具很可能為生物監(jiān)測方法的“下一代”奠定基礎(chǔ)，可能徹底改變淡水生態(tài)系統(tǒng)的常規(guī)監(jiān)測和管理[4,5]。這些方法大量借鑒了最初開發(fā)用于量化微生物多樣性的方法，但擴展到同時檢測從微觀到宏觀生物的所有分類群。這種方法從環(huán)境樣品中分離的核酸包含源自該生態(tài)系統(tǒng)中存在的所有生物的糞便，粘液，脫落組織或腐爛物質(zhì)等環(huán)境DNA（eDNA）。因此，對PCR擴增的微小修改可以定量樣品中存在的所有物種。這些方法的潛力巨大，克服與分類學(xué)專業(yè)知識的可用性相關(guān)的問題，以及當(dāng)前生物監(jiān)測方法的非標(biāo)準(zhǔn)化。因此，使用eDNA方法量化生物多樣性正在迅速增長并推動持續(xù)的方法改進，并將很快成為淡水棲息地的常規(guī)方法。
雖然分子工具在監(jiān)測淡水生物多樣性方面有巨大潛力，但只檢查食物網(wǎng)中的微生物成分可以快速、實時地衡量當(dāng)代生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。如前所述（參見案例研究），微生物群落幾乎立即對環(huán)境變化做出反應(yīng)，從而為環(huán)境管理部門提供了一個“警告”系統(tǒng)。實際上，許多化學(xué)應(yīng)激物進入食物網(wǎng)的途徑是通過基礎(chǔ)微生物的生物膜。這些不是新概念，微生物真核生物，如硅藻，通常用于生物監(jiān)測。例如，營養(yǎng)硅藻指數(shù)（TDI）表示水體的營養(yǎng)狀態(tài)，并且基于與不同營養(yǎng)狀態(tài)的水相關(guān)的某些硅藻類群的存在。然而，TDI需要耗時的形態(tài)識別一組具有挑戰(zhàn)性的生物，并且通過分子方法更新因形態(tài)學(xué)和分子分類學(xué)之間的脫節(jié)而受到阻礙[6,7]。然而，隨著技術(shù)的發(fā)展，我們可預(yù)見到克服目前的限制，并通過對微生物群落的常規(guī)監(jiān)測，可快速檢測淡水生態(tài)系統(tǒng)中的新應(yīng)激源。
通過提供便攜式現(xiàn)場技術(shù)，未來的發(fā)展也可以減少對專用分子實驗室的需求[4]。例如，Nanopore MinION已經(jīng)為研究人員提供了現(xiàn)場NGS測序能力，但需要改進序列質(zhì)量[8]。然而，PCR技術(shù)的小型化目前允許對于宏基因組學(xué)和qPCR進行現(xiàn)場核酸擴增[9]。這些開發(fā)與易于編程的微型計算機（例如，Raspberry Pi）[10]相結(jié)合，使全自動，遠(yuǎn)程分子生物監(jiān)測的有趣前景更接近現(xiàn)實。這有可能更快地識別環(huán)境擾動，從而更快地實施補救措施，同時減少可能影響微生物群落組成的樣品處理和儲存問題。后一點對于基于RNA的方法（例如，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)）特別重要，因為其在專用-80℃儲存之外的半衰期短且不穩(wěn)定。
直到最近，由于缺乏分類學(xué)注釋的功能基因數(shù)據(jù)庫，連接系統(tǒng)發(fā)育和功能基因數(shù)據(jù)一直具有挑戰(zhàn)性，促使生物信息學(xué)方法試圖“預(yù)測”來自系統(tǒng)發(fā)育序列數(shù)據(jù)的功能性狀，例如PICRUSt。隨后，將功能基因與系統(tǒng)發(fā)育信息基因全面連接的唯一方法是分離篩選感興趣的生物體，并對其整個基因組進行測序，這受到大多數(shù)微生物（缺乏）可培養(yǎng)性的限制。然而，epicPCR可以通過在分離核酸之前捕獲乳液液滴中的單個微小細(xì)胞來克服這種限制，從而允許系統(tǒng)發(fā)育和功能基因的共擴增[11]?；蛘?，單細(xì)胞基因組學(xué)方法能夠在基因組測序之前從混合群體中分離單個微生物細(xì)胞（例如，通過流式細(xì)胞術(shù)），從而消除了在純培養(yǎng)物中分離細(xì)胞的需要。單細(xì)胞“組學(xué)”方法已經(jīng)揭示了淡水系統(tǒng)中生態(tài)重要微生物的未知功能[12]。高通量與單細(xì)胞“組學(xué)”的耦合引入了對水生微生物群落功能和系統(tǒng)發(fā)育的研究擁有誘人的前景[13]。這些方法提供了同時評估微生物分類學(xué)和功能多樣性的新穎且潛在的高通量方法；可以說是實現(xiàn)了具有生態(tài)意義的數(shù)據(jù)的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
5 | CONCLUDING REMARKS
分子技術(shù)的迅速發(fā)展提供前所未有的詳細(xì)研究淡水微生物群落的工具。隨著微生物在其中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，從而對淡水棲息地進行更全面的了解。目前，分子微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展正在更廣泛的生態(tài)研究界得到應(yīng)用；如改進生物監(jiān)測，重新定義食物網(wǎng)，并檢查以前忽略的微生物類群的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。作用于淡水生態(tài)系統(tǒng)的多種壓力源的持續(xù)增加導(dǎo)致環(huán)境管理面臨越來越大的挑戰(zhàn)，但隨著我們可以使用的最新分子工具的產(chǎn)生，微生物群落在滿足和理解這些挑戰(zhàn)中的作用將永遠(yuǎn)不會被忽視。
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