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• 文/江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 王會(huì)聰、沈曉露、劉云

上海海洋大學(xué)水生動(dòng)物病原庫(kù) 曹海鵬

烈性噬菌體（本文簡(jiǎn)稱“噬菌體”）是一類細(xì)菌性病毒，能夠通過入侵細(xì)菌在菌體內(nèi)繁殖并在短時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)菌株裂解的病毒，具有繁殖迅速、專一性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。正是因?yàn)檫@一特性，噬菌體被國(guó)內(nèi)外研究者青睞，逐漸應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖進(jìn)行細(xì)菌性病害控制，展現(xiàn)了良好的應(yīng)用效果。例如，噬菌體能夠顯著降低大西洋鮭、塞內(nèi)加爾鰨、溪紅點(diǎn)鮭因殺鮭氣單胞菌感染而造成的死亡率（呂可等，2020）。然而，目前噬菌體在國(guó)內(nèi)尚未獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部合法使用的許可，但將來能否開發(fā)成為水產(chǎn)獸用生物制品，筆者就噬菌體應(yīng)用中存在的問題談?wù)剛€(gè)人看法，以供參考。

噬菌體裂解細(xì)菌具有嚴(yán)格的宿主特異性，但大多數(shù)噬菌體僅對(duì)某種細(xì)菌里的某些特定菌株具有裂解作用。例如，朱秋華等（2021）檢測(cè)了溶藻弧菌噬菌體Va2001對(duì)46株不同分離源的溶藻弧菌的裂解作用，發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌噬菌體Va2001僅能裂解其中的16株溶藻弧菌。即使少數(shù)噬菌體被發(fā)現(xiàn)具有寬譜特性，但實(shí)驗(yàn)證明其噬菌譜依然很窄。例如，鐘宛宣等（2021）通過分析2株溶藻弧菌噬菌體R10Z和R11Z對(duì)包括溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌、歐文斯弧菌等在內(nèi)的11種20株弧菌的裂解活性，發(fā)現(xiàn)這兩株溶藻弧菌噬菌體僅能裂解1株溶藻弧菌和1株歐文斯弧菌。張洋等（2021）通過分析嗜水氣單胞菌噬菌體PZL-Ah1對(duì)包括嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌等在內(nèi)的2種40株氣單胞菌的裂解活性，發(fā)現(xiàn)噬菌體PZL-Ah1僅能裂解4株嗜水氣單胞菌和3株維氏氣單胞菌。因此，噬菌體進(jìn)行預(yù)防應(yīng)用難度較大，應(yīng)注重“治”，需在分離鑒定出水產(chǎn)動(dòng)物疾病致病菌株的基礎(chǔ)上，通過篩選出致病菌株噬菌體再進(jìn)行應(yīng)用。

在噬菌體制劑的制備過程中，噬菌體的增殖需要依賴宿主菌，但噬菌體在裂解宿主菌的過程中會(huì)釋放出內(nèi)毒素（魯會(huì)軍等，2002）。此外，噬菌體是某些毒素基因和抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移的重要載體。早在1987年研究人員就發(fā)現(xiàn)控制大腸桿菌的不耐熱腸毒素產(chǎn)物的基因是由噬菌體介導(dǎo)的（王靜等，2011）。楊亦文等（2020）研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖廢水中含有高豐度的噬菌體攜帶抗性基因（如磺胺類抗性基因）；陳莫蓮等（2021）也指出噬菌體介導(dǎo)的抗生素抗性基因(ARGs)的水平轉(zhuǎn)移是環(huán)境中抗性基因擴(kuò)散的重要機(jī)制，對(duì)全球的公共衛(wèi)生和食品安全造成了威脅。因此，噬菌體在研發(fā)與應(yīng)用時(shí)需注意避免對(duì)環(huán)境帶來安全風(fēng)險(xiǎn)。

噬菌體完成一個(gè)復(fù)制周期需要經(jīng)過吸附、核酸注入、核酸復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)合成、裝配及釋放等幾個(gè)步驟，噬菌體的宿主菌株阻礙其中任何步驟均可導(dǎo)致其對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。例如，在檢測(cè)噬菌體的裂解作用時(shí)，研究人員常常發(fā)現(xiàn)噬菌體產(chǎn)生的噬菌斑并未隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變大，可能是宿主菌株對(duì)其產(chǎn)生抗性的表現(xiàn)。此外，噬菌體抗性菌株也并未因其對(duì)噬菌體抗性的產(chǎn)生而使其喪失致病性。例如。包紅朵等（2020）通過次級(jí)感染法和雙層平板法篩選出沙門菌噬菌體抗性菌R3，其生物學(xué)特性、毒力基因及對(duì)MODE-K細(xì)胞粘附能力與噬菌體宿主菌相比沒有顯著改變，仍然具有一定的致病性。因此，噬菌體在應(yīng)用時(shí)應(yīng)注重使用后環(huán)境中有無抗性致病菌株的產(chǎn)生。

噬菌體的應(yīng)用效果受到貯存條件、治療最佳時(shí)間、使用劑量和使用方式等諸多因素的影響。例如，噬菌體在室溫和亞高溫下貯存穩(wěn)定性差，噬菌體容易死亡，因而一般需要低溫貯存；噬菌體拌飼口服投喂水產(chǎn)動(dòng)物時(shí)，因其作為異源物質(zhì)具有很強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可能抑制噬菌體的殺菌能力（戴瑜來等，2019），而且噬菌體只能裂解對(duì)其敏感的宿主菌株，并且在宿主菌株達(dá)到一定密度時(shí)才能增殖，使用過早或使用劑量不合適，可能會(huì)在開始增殖（裂解宿主菌株）前就被水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體清除而難以發(fā)揮噬菌作用，這也是噬菌體治療的一大難點(diǎn)（王靜等，2011）。例如，Park等（2003）從噬菌體治療后但仍然病死的香魚體內(nèi)未分離出噬菌體抗性突變菌株，提示體內(nèi)的病原菌能夠在沒有發(fā)生抗性突變的情況下能夠逃避噬菌體的裂解（呂可等，2020）；Madsen等（2013）向虹鱒幼苗腹腔注射10⁴CFU/尾嗜冷黃桿菌，再腹腔注射10⁴ PFU/尾噬菌體，發(fā)現(xiàn)噬菌體未能減少魚的死亡率。此外，在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中，養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)的致病菌復(fù)雜，往往具有種的多樣性和菌株的差異性（不止一種致病菌，每種致病菌同時(shí)也具有菌株差異）， 導(dǎo)致噬菌體在控制混合性細(xì)菌感染的難度較大。因此，噬菌體應(yīng)用技術(shù)的優(yōu)化是噬菌體在養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中展現(xiàn)令人滿意的效果的重要內(nèi)容。