摘要
整合多組學(xué)數(shù)據(jù)集對(duì)微生物組研究至關(guān)重要；然而，推斷跨組學(xué)數(shù)據(jù)集的相互作用有多種統(tǒng)計(jì)挑戰(zhàn)。我們通過(guò)使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（https://github.com/biocore/mmvec）估計(jì)每個(gè)分子在特定微生物存在的情況下存在的條件概率來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。我們用已知的環(huán)境（沙漠土壤結(jié)皮濕潤(rùn)）和臨床（囊性纖維化肺）的例子，展示了我們恢復(fù)微生物-代謝物關(guān)系的能力，并演示了該方法如何發(fā)現(xiàn)微生物產(chǎn)生的代謝物和炎癥性腸病之間的關(guān)系。
引言
通過(guò)整合互補(bǔ)的組學(xué)數(shù)據(jù)獲得的知識(shí)將提升微生物產(chǎn)品的檢測(cè)和優(yōu)化未定性微生物的培養(yǎng)條件。以前的工作已經(jīng)能夠從微生物豐度曲線預(yù)測(cè)代謝物豐度曲線。然而，由于傳統(tǒng)的相關(guān)技術(shù)具有不可接受的高假發(fā)現(xiàn)率，在復(fù)雜的微生物組內(nèi)的基因和它們?cè)诖x組中的產(chǎn)物之間找到有意義的關(guān)系是具有挑戰(zhàn)性的。
盡管人們普遍努力開(kāi)發(fā)多組學(xué)方法，但一些概念上的挑戰(zhàn)限制了整合不同的組學(xué)數(shù)據(jù)的技術(shù)，例如，將微生物測(cè)序和非目標(biāo)質(zhì)譜聯(lián)系起來(lái)。因此，需要新的方法來(lái)處理不同的數(shù)據(jù)類(lèi)型。數(shù)以千計(jì)的微生物和代謝物的相對(duì)豐度可以分別用測(cè)序技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)測(cè)量，從而產(chǎn)生高維微生物組和代謝組數(shù)據(jù)集。從這些豐度中量化微生物-代謝物的相互作用需要估計(jì)所有可能的微生物-代謝物相互作用的分布。
諸如典型對(duì)應(yīng)分析（CCA）和偏最小二乘法（PLS）等技術(shù)使用低維表示法對(duì)這種聯(lián)合分布進(jìn)行近似。網(wǎng)絡(luò)模型已被證明可以提高使用多個(gè)數(shù)據(jù)集的分類(lèi)準(zhǔn)確性。因子模型已被提出來(lái)，以結(jié)合多個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物標(biāo)志物分析。盡管這些方法應(yīng)用廣泛，但它們出了名的難以解釋?zhuān)疫@些模型是否能獲得單個(gè)微生物-代謝物的相互作用仍不清楚。
Pearson's和Spearman's相關(guān)性假設(shè)相互作用之間是獨(dú)立的，通過(guò)將其簡(jiǎn)化為獨(dú)立的二維問(wèn)題的組合，簡(jiǎn)化了估計(jì)程序。然而，許多研究表明，這些方法中的簡(jiǎn)化對(duì)組成數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是無(wú)效的，這是Pearson在1895年首次認(rèn)識(shí)到的事實(shí)，并在許多研究中得到跟進(jìn)。這個(gè)問(wèn)題進(jìn)一步復(fù)雜化，因?yàn)槲⑸锝M和質(zhì)譜數(shù)據(jù)集也是組成性的，這意味著絕對(duì)豐度沒(méi)有被測(cè)量，這可能混淆統(tǒng)計(jì)推斷。例如，在非目標(biāo)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)到的分子集及其相對(duì)豐度取決于所使用的提取協(xié)議和分析方法，這導(dǎo)致了代謝組的部分快照。此外，在大規(guī)模的代謝組學(xué)工作中，通常不測(cè)量提取的分子的總質(zhì)量，因?yàn)檫@一步驟非常費(fèi)力。
為了了解與組成數(shù)據(jù)相關(guān)的問(wèn)題如何影響微生物代謝物相互作用的推斷，我們?cè)谘a(bǔ)充圖1中說(shuō)明了一個(gè)例子。僅僅是這些問(wèn)題就會(huì)產(chǎn)生大量的假陽(yáng)性和假陰性，使得Pearson和Spearman在某些情況下可以與隨機(jī)擲硬幣相媲美。目前，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證需要大型實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)多年時(shí)間來(lái)進(jìn)行，往往需要耗時(shí)的人工檢查錯(cuò)誤的相關(guān)性。
還有其他一些組成技術(shù)，如SparCC和比例性，在分析單個(gè)數(shù)據(jù)集時(shí)是規(guī)模不變的，但在分析多組學(xué)數(shù)據(jù)集時(shí)就失去了規(guī)模不變性。這在識(shí)別微生物-真菌相互作用的背景下顯示出來(lái)，這為擴(kuò)展SPIEC-EASI以處理多組學(xué)數(shù)據(jù)集提供了動(dòng)力。我們表明，這種方法對(duì)微生物-代謝物的相互作用不起作用，因?yàn)闇y(cè)序和質(zhì)譜測(cè)量之間的測(cè)量單位不同（補(bǔ)充說(shuō)明）。另一種方法是考慮共同發(fā)生的概率，而不是相關(guān)關(guān)系。這里，共同發(fā)生概率指的是在觀察到微生物的情況下觀察到代謝物的條件概率，從而使我們能夠確定最可能的微生物-代謝物相互作用。為此，我們提出了 "mmvec"(microbe–metabolite vectors)，這是一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以從單個(gè)微生物序列預(yù)測(cè)整個(gè)代謝物豐度概況（圖1）。通過(guò)迭代訓(xùn)練，mmvec可以學(xué)習(xí)微生物和代謝物之間的共同發(fā)生概率。微生物-代謝物的相互作用可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的降維界面進(jìn)行排序和可視化，從而獲得可解釋的結(jié)果。mmvec背后的計(jì)算利用了現(xiàn)代圖形處理單元（GPU）架構(gòu)，使用Tensorflow，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大型多組學(xué)數(shù)據(jù)集的可擴(kuò)展推理。此外，我們?cè)趦蓚€(gè)基準(zhǔn)測(cè)試和四個(gè)案例研究中提供了證據(jù)，證明mmvec優(yōu)于現(xiàn)有的統(tǒng)計(jì)方法。
結(jié)果
我們使用模擬囊性纖維化生物膜的數(shù)據(jù)集進(jìn)行了mmvec與Pearson's、Spearman's、SPIEC-EASI、SparCC和比例的比較。然后，我們展示了mmvec可以在沙漠土壤生物殼濕潤(rùn)的研究中解決相互矛盾的藍(lán)藻-代謝物關(guān)系。我們還展示了在囊性纖維化中觀察到的由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的代謝物的已知關(guān)聯(lián)的恢復(fù)。最后，我們探討了喂養(yǎng)高脂肪飲食（HFD）的小鼠和炎癥性腸病期間的微生物群和代謝變化之間的關(guān)系，顯示了這種方法如何被用來(lái)確定分子的微生物來(lái)源，甚至在極其復(fù)雜的現(xiàn)實(shí)生活的生物系統(tǒng)中，對(duì)現(xiàn)有關(guān)聯(lián)的了解是有限的情況下。
仿真基準(zhǔn)。
為了比較mmvec與Pearson's, Spearman's, proportionality, SparCC和SPIEC-EASI相關(guān)性的性能，我們使用了現(xiàn)有研究的數(shù)據(jù)，其中微生物和代謝物之間的關(guān)系是調(diào)查的核心焦點(diǎn)。其中一項(xiàng)研究模擬了微生物生物膜中的空間-時(shí)間動(dòng)態(tài)。最初的研究測(cè)試了這樣一個(gè)假設(shè)：人類(lèi)肺部的囊性纖維化微生物群落可以通過(guò)改變其化學(xué)環(huán)境而被操縱。在不使用抗生素的情況下，pH值和氧飽和度的變化通過(guò)促進(jìn)發(fā)酵劑（fermenters ）群落的生長(zhǎng)來(lái)抑制主要的病原體--銅綠假單胞菌，而這些發(fā)酵劑群落的生長(zhǎng)會(huì)超過(guò)該病原體。這個(gè)系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性允許對(duì)高層次的生態(tài)模式進(jìn)行建模。在最初的模擬中，兩個(gè)微生物（用θf(wàn)表示的發(fā)酵劑和用θp表示的銅綠假單胞菌）和多個(gè)分子之間的相互作用是用Monad動(dòng)力學(xué)和擴(kuò)散過(guò)程建模的（圖2a）。
我們模擬了微生物DNA測(cè)序和代謝物非靶向質(zhì)譜的測(cè)量過(guò)程（方法），為它們的相互作用提供了基礎(chǔ)真實(shí)信息。該模型模擬了銅綠假單胞菌和發(fā)酵劑之間的相互作用，以及它們與環(huán)境的相互作用。它還模擬了微生物和分子之間已知的相互作用，如發(fā)酵劑的糖消耗和病原體的氨生產(chǎn)。
因此，我們可以測(cè)試與每個(gè)微生物相關(guān)的前K個(gè)代謝物是否包括正確的微生物-代謝物相互作用。圖2c顯示了每個(gè)工具的特異性和敏感性與K的關(guān)系，其中除了mmvec和SPIEC-EASI，隨機(jī)機(jī)會(huì)的表現(xiàn)優(yōu)于所有的工具，其中mmvec的表現(xiàn)最好。如圖2d和補(bǔ)充圖2所示，mmvec是唯一對(duì)尺度偏差穩(wěn)健的方法。這對(duì)于保持絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度之間的一致性至關(guān)重要，否則會(huì)導(dǎo)致虛高的假陽(yáng)性和假陰性。
土壤生物結(jié)殼濕潤(rùn)事件。
改進(jìn)數(shù)據(jù)分析可以幫助解決以前不一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是在環(huán)境和臨床環(huán)境中。為了測(cè)試mmvec是否能解決不同研究中微生物-代謝物相互作用中無(wú)法解釋的差異，我們將其應(yīng)用于生物結(jié)殼濕潤(rùn)的研究。在這項(xiàng)工作中，作者確定了多種生物結(jié)殼分離物（包括Microcoleus vaginatus和兩個(gè)芽孢桿菌菌株）消耗和釋放的代謝物，并將這些模式與密切相關(guān)的環(huán)境類(lèi)群和原地觀察到的代謝物進(jìn)行比較。
雖然在濕潤(rùn)事件后，近70%的受檢微生物-代謝物關(guān)系得到了驗(yàn)證，但有些與培養(yǎng)物中觀察到的微生物-代謝物關(guān)系相矛盾。這些矛盾源于M. vaginatus豐度和觀察到的代謝物豐度之間的Spearman's相關(guān)性，但被mmvec所解決（圖3a）。
所有從M. vaginatus分離物中釋放出來(lái)的代謝物的條件概率都高于生物殼濕潤(rùn)后的平均代謝物，并且是與M. vaginatus共同出現(xiàn)的前40種代謝物（共85個(gè)分子）之一。這一結(jié)果支持了最初的發(fā)現(xiàn)，即M. vaginatus在濕潤(rùn)事件后實(shí)際釋放了這些分子。相比之下，Spearman's給這些分子的13個(gè)中的7個(gè)貼上了負(fù)相關(guān)的標(biāo)簽（圖3a），表明這些分子是被M. vaginatus消耗的，而不是像最初所說(shuō)的那樣被釋放。當(dāng)不同統(tǒng)計(jì)方法的注釋檢測(cè)率不同時(shí)，mmvec的真陽(yáng)性率要高得多，如圖3b所示。
mmvec和Spearman's之間的沖突結(jié)果可以解釋為濕潤(rùn)后微生物生物量的增長(zhǎng)和可用資源的轉(zhuǎn)移（圖3c,d）?？偟纳锪款A(yù)計(jì)會(huì)增加，因?yàn)镸. vaginatus釋放的代謝物使許多其他微生物生長(zhǎng)。DNA測(cè)序只能測(cè)量比例，其他微生物的生長(zhǎng)可能因此導(dǎo)致M. vaginatus的比例下降，從而導(dǎo)致與4-胍基丁酸的反相關(guān)關(guān)系的誤導(dǎo)（圖3d）。
相對(duì)于其他受益于代謝物釋放的微生物來(lái)說(shuō)，M. vaginatus可能以較慢的速度生長(zhǎng)。由于mmvec不依賴(lài)總生物量的知識(shí)，也不對(duì)相對(duì)豐度進(jìn)行歸一化處理，因此避免了這些矛盾。然而，不可能推斷出M. vaginatus的豐度是在減少還是4-胍基丁酸鹽的豐度在增加。
囊性纖維化
為了進(jìn)一步驗(yàn)證mmvec是否能檢測(cè)到已知的微生物-代謝物相互作用，分析了一項(xiàng)關(guān)于囊性纖維化患者的肺部粘液微生物組的研究。囊性纖維化已被證明由兩大類(lèi)微生物主導(dǎo)，即厭氧菌和病原體，它們占據(jù)獨(dú)特的生態(tài)位，其相互作用由環(huán)境決定。厭氧菌在低氧和低pH環(huán)境中占主導(dǎo)地位，而病原體，特別是銅綠假單胞菌，在相反的條件下占主導(dǎo)地位。mmvec清楚地將厭氧菌和病原體分開(kāi)（圖4a），左邊是已知的厭氧微生物（Veillonella, Fusobacterium, Prevotella和Streptococcus），右邊是明顯的病原體，如銅綠假單胞菌。眾所周知，銅綠假單胞菌能產(chǎn)生小分子毒力因子。在最初的研究中，根據(jù)全球天然產(chǎn)品社會(huì)分子網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)（GNPS）的注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)該細(xì)菌產(chǎn)生六種分子。4-羥基-2-庚基喹啉、焦黃素、奮乃靜-1-羧酸、2-壬基-4-羥基喹啉、2-庚基-3,4-二羥基喹啉（假單胞菌喹諾酮信號(hào)）和pyochelin。如圖4a所示，mmvec識(shí)別的這些分子與銅綠假單胞菌共同出現(xiàn)的概率很高。Mmvec菌還確定了一個(gè)可能由銅綠假單胞產(chǎn)生的鼠李糖脂的集群。鼠李糖脂的特性很好，是銅綠假單胞菌的一個(gè)重要毒力因素，有助于生物膜的發(fā)展、表面的運(yùn)動(dòng)能力以及與宿主炎癥細(xì)胞的拮抗作用。這些鼠李糖脂在最初的研究中沒(méi)有被確認(rèn)。這些化合物的注釋已經(jīng)用GNPS34建立。
從mmvec學(xué)到的第一主成分與跨氧梯度的代謝物的log倍數(shù)變化之間存在負(fù)相關(guān)（圖4b）（Pearson's r = -0.59, P = 1.8 × 10-44, n = 442個(gè)分子），這與原始工作中的發(fā)現(xiàn)一致。通過(guò)Pearson's（r = 0.11, P = 0.16, n = 138個(gè)微生物）沒(méi)有發(fā)現(xiàn)氧氣梯度和第一個(gè)微生物主成分之間的這種相關(guān)性。在第一個(gè)微生物主成分的兩端，存在兩種值得注意的微生物。綠膿桿菌，一種已知的病原體，和鏈球菌，一種已知的厭氧菌。在銅綠假單胞菌和鏈球菌是最豐富的物種的樣品中，銅綠假單胞菌和鏈球菌特有的前100種代謝物顯示出截然不同的特征（圖4d,e）（對(duì)數(shù)比t檢驗(yàn)=6.51，P=4.4×10-8，n=49個(gè)樣品）。這提供了證據(jù)，在本研究的背景下，代謝組圖譜可以在很大程度上受到最豐富的微生物的影響，這一概念對(duì)理解囊性纖維化病因有重要意義。為了進(jìn)一步支持這一點(diǎn)，學(xué)習(xí)到的銅綠假單胞菌的代謝物條件概率可以用來(lái)預(yù)測(cè)銅綠假單胞菌是最豐富的分類(lèi)群的41個(gè)樣本中的代謝物比例。僅僅預(yù)測(cè)銅綠假單胞菌的代謝物概況就可以解釋這些樣品中10%的代謝物變化（r = 0.319, P = 1.18 × 10-11, n = 442個(gè)分子）。
在已知由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的14個(gè)喹諾酮類(lèi)分子中，皮爾遜相關(guān)法檢測(cè)到9個(gè)，在沒(méi)有錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正的情況下，P<0.05，而在FDR校正后，只有5個(gè)。例如，從原始比例來(lái)看，焦藍(lán)蛋白似乎與銅綠假單胞菌沒(méi)有關(guān)系（r=0.158，F(xiàn)DR校正后P=0.089，排名=96，n=172個(gè)樣本），但通過(guò)mmvec排名第34位，與銅綠假單胞菌最相關(guān)（補(bǔ)充圖3c），與培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明銅綠假單胞菌產(chǎn)生這種分子一致。18種鼠李糖脂是通過(guò)mmvec與銅綠假單胞菌最相關(guān)的前25種代謝物之一，并且與mmvec的排名比與Pearson's correlation的排名高（補(bǔ)充圖3b）。
高脂肪飲食對(duì)小鼠模型的影響
然后我們測(cè)試了mmvec是否能確定復(fù)雜生物系統(tǒng)中特定分子的微生物來(lái)源。我們最近發(fā)現(xiàn)了一種新的膽汁酸，其中膽酸與甘氨酸和?；撬嵋酝獾陌被峁曹棥＿@些分子隨著人類(lèi)的HFD增加了豐度。我們確定這些分子是由微生物制造的，因?yàn)樗鼈兇嬖谟跓o(wú)特定病原體的小鼠中，但在無(wú)菌小鼠中不存在。因此，我們著手確定候選生產(chǎn)商。我們能夠確認(rèn)這些膽汁酸之一，膽酸苯丙氨酸酰胺，在一項(xiàng)控制良好的研究中與HFD有關(guān)，該研究調(diào)查了小鼠模型中的非酒精性脂肪肝、肝硬化和肝癌的發(fā)展。當(dāng)通過(guò)多項(xiàng)式回歸重新分析這些數(shù)據(jù)集的差異豐度時(shí)，膽汁酸與HFD的強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)立即變得明顯。使用mmvec顯示了與HFD相關(guān)的不同微生物組（圖5a），并根據(jù)飲食對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了明確的分層（圖5b）。一些梭狀芽孢桿菌與膽酸苯丙氨酸共軛物相關(guān)。事實(shí)上，我們表明梭狀芽孢桿菌屬被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生這種膽汁酸。這一結(jié)果表明，mmvec有能力簡(jiǎn)化對(duì)產(chǎn)生特定感興趣分子的微生物的發(fā)現(xiàn)。
炎癥性腸病中微生物-代謝物的相互作用
最后，對(duì)綜合人類(lèi)微生物組計(jì)劃下產(chǎn)生的炎癥性腸?。↖BD）患者的樣本進(jìn)行了微生物-代謝物相互作用的研究。微生物組在IBD中的作用是公認(rèn)的，但人們對(duì)它的了解仍然很有限。最初的研究發(fā)現(xiàn)了與IBD相關(guān)的代謝組學(xué)和微生物概況的變化。特別是，肉堿和膽汁酸的水平被證明受到影響。使用mmvec，我們證實(shí)了先前研究的核心發(fā)現(xiàn)，如玫瑰菌和多種肉堿（包括先前提到的C20）之間的共同存在，這具有抗炎特性（圖6a）。我們還發(fā)現(xiàn)Klebsiella spp.和IBD狀態(tài)之間有很高的相關(guān)性，而且Klebsiella spp.與幾種膽汁酸共存的概率很高（圖6b）。盡管Klebsiella spp.不產(chǎn)生這些化合物，但一些病原體（包括克雷伯氏菌）已知對(duì)膽汁酸有抵抗力。膽汁酸的過(guò)度產(chǎn)生和膽汁酸吸收不良可導(dǎo)致膽汁酸過(guò)量，這是IBD的一個(gè)特征，盡管確切的機(jī)制仍然未知?？死撞暇跐饪s的膽汁酸環(huán)境中茁壯成長(zhǎng)的能力與圖6b中顯示的高共現(xiàn)概率相一致。我們還注意到，三個(gè)克雷伯氏菌是IBD相關(guān)分子的首要驅(qū)動(dòng)因素（圖6c）。劃分共同出現(xiàn)的不同原因是很重要的。與克雷伯氏菌不同，梭菌類(lèi)以操縱膽汁酸而聞名，包括生產(chǎn)能使艱難梭菌孢子發(fā)芽或具有抗菌特性的膽汁酸。
因此，在梭狀芽孢桿菌的情況下，現(xiàn)有的共同出現(xiàn)（圖6b）可能是由于所指出的微生物物種對(duì)代謝物的實(shí)際生物合成，而不是對(duì)其的承受能力。
除了重述報(bào)道的結(jié)果外，mmvec還產(chǎn)生了以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)與健康病人有關(guān)的主要微生物是丙酸桿菌科，而在Lloyd-Price等人的研究中沒(méi)有檢測(cè)到（圖6c,d）。這種關(guān)系得到了其他已發(fā)表研究的證實(shí)。在一項(xiàng)研究中顯示，丙酸桿菌屬的一些成員會(huì)產(chǎn)生1,4-二羥基-2-萘甲酸（DHNA），這是一種對(duì)雙歧桿菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)刺激劑，被認(rèn)為可以減輕IBD的癥狀。另外，在一項(xiàng)調(diào)查中
在體內(nèi)與體外細(xì)菌活動(dòng)的調(diào)查中，Probionibacterium freudenreichii被證明在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中起到免疫調(diào)節(jié)的作用。在另一項(xiàng)研究中顯示，在抗炎益生菌發(fā)酵乳制品中，F(xiàn)reudenreichii丙酸桿菌是一種可行的核心成分。這個(gè)家族的成員被認(rèn)為對(duì)腸道免疫調(diào)節(jié)有益；已經(jīng)觀察到丙酸桿菌在人類(lèi)母乳中富集，并被證明可以恢復(fù)Th17分化。因此，現(xiàn)有的知識(shí)似乎支持mmvec所發(fā)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)推斷的相互作用，但在最初的分析中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。
討論
在模擬基準(zhǔn)和注釋數(shù)據(jù)集中，mmvec在從多組學(xué)數(shù)據(jù)集推斷微生物-代謝物相互作用方面表現(xiàn)出更好的性能。我們的結(jié)果表明，在模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，mmvec優(yōu)于所有旨在推斷成對(duì)的微生物-代謝物豐度數(shù)據(jù)集之間相互作用的現(xiàn)有工具。在生物殼濕潤(rùn)實(shí)驗(yàn)中，mmvec解決了體外驗(yàn)證的釋放M. vaginatus的代謝物與環(huán)境樣品的測(cè)序和質(zhì)譜分析之間的矛盾結(jié)果。在囊腫性纖維化的研究中，mmvec可以可靠地識(shí)別由銅綠假單胞菌產(chǎn)生的所有實(shí)驗(yàn)確定的感興趣的分子。我們?cè)谀懼岙a(chǎn)生的例子中顯示，mmvec能夠在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中進(jìn)行探索性分析，并簡(jiǎn)化發(fā)現(xiàn)特定代謝物的微生物來(lái)源。最后，mmvec能夠識(shí)別IBD研究中對(duì)代謝物豐度貢獻(xiàn)最大的微生物，而這些微生物中的一種在最初的研究中被忽略了。
鑒于這些發(fā)現(xiàn)，目前的方法仍然有局限性。目前仍不清楚如何利用共同發(fā)生概率來(lái)獲取相互作用的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣，還不能計(jì)算每個(gè)微生物-代謝物相互作用強(qiáng)度的置信區(qū)間。此外，還需要理論工作來(lái)處理具有連續(xù)值的輸入。
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