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作者：魯鳳民　曾婉嘉　文夏杰　廖昊　鄒軍　王雷婕　席婧媛　王建文　王杰　陳香梅

基金項(xiàng)目：“十三五”傳染病防治科技重大專項(xiàng)（2017ZX10302201）

作者單位：100191 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系暨感染病研究中心

通信作者：

魯鳳民，Email：lu.fengmin@hsc.pku.edu.cn；

陳香梅，Email：xm_chen6176@bjmu.edu.cn

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我國病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的最主要致病因素，我國現(xiàn)有慢性HBV感染者約7800萬人，慢性乙型肝炎（CHB）患者約2400萬人^[1]。隨著疾病進(jìn)展，約20%~40% CHB患者將發(fā)展為肝硬化、肝硬化失代償?shù)冉K末期肝病及肝癌^[2]。我國的肝癌患者占全世界新發(fā)肝癌病例的50%以上，且80%以上的病例與慢性HBV感染有關(guān)。因此對CHB患者開展及時(shí)、規(guī)范的抗病毒治療以阻斷疾病進(jìn)展，減少終末期肝病的發(fā)生至關(guān)重要。

目前臨床上使用的抗病毒藥物主要有長效干擾素和核苷（酸）類藥物（NAs）。NAs抑制病毒復(fù)制的作用更為明顯，且口服方便、不良反應(yīng)相對較少，在臨床上被廣泛使用。但無論是NAs還是長效干擾素，各大指南目前僅推薦對有明顯肝臟炎癥及肝纖維化、肝硬化的CHB患者進(jìn)行抗病毒治療。本文總結(jié)了當(dāng)前CHB在實(shí)驗(yàn)室診斷和治療療效監(jiān)測中遇到的新問題，同時(shí)也討論了近期發(fā)現(xiàn)的CHB新型標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值，并對這些標(biāo)志物在CHB抗病毒治療中的應(yīng)用進(jìn)行展望。

一、慢性HBV感染的自然史

慢性HBV感染是一個(gè)病毒復(fù)制與宿主免疫相互作用的動(dòng)態(tài)過程，其自然史可分為四個(gè)時(shí)期，分別是免疫耐受期、免疫清除期、低活動(dòng)或非復(fù)制期和再活動(dòng)期。免疫耐受期的血清HBV DNA水平很高，但肝臟的免疫病理損傷輕微，ALT正?；騼H略升高，稱為HBeAg陽性慢性HBV感染。隨著機(jī)體免疫耐受狀態(tài)被打破進(jìn)入免疫清除期，患者出現(xiàn)典型的慢性肝炎癥狀，也稱為HBeAg陽性CHB。持續(xù)的免疫應(yīng)答會(huì)使部分CHB患者的病毒復(fù)制被控制，肝臟炎癥得到改善，反映病毒活躍復(fù)制的HBeAg轉(zhuǎn)陰，進(jìn)入免疫控制期，即HBeAg陰性慢性HBV感染。其中有些患者會(huì)發(fā)生病毒復(fù)制再激活，并引發(fā)肝臟炎癥損傷，成為HBeAg陰性CHB患者（圖1）。

圖1 慢性HBV感染的自然史（修改自文獻(xiàn)）[2]

二、CHB抗病毒治療相關(guān)實(shí)驗(yàn)室診斷和療效監(jiān)測中遇到的新問題

（一）如何確定亟需抗病毒治療的CHB患者，并使其得到及時(shí)治療？

因活動(dòng)性肝臟炎癥會(huì)加速疾病進(jìn)展，需要及早進(jìn)行抗病毒治療，因此，包括ESAL/APASL/AASLD在內(nèi)的各大指南均以血清HBV DNA、血清ALT水平和肝臟疾病嚴(yán)重程度來聯(lián)合評判是否開始CHB的抗病毒治療。目前臨床上多以ALT的異常升高作為肝臟炎癥損傷的判定指標(biāo)，但多項(xiàng)研究顯示，有13.8%~47.65%的CHB患者盡管存在明顯的肝臟炎癥損傷，但ALT并無明顯升高^[3]?？紤]到ALT指標(biāo)不足以完全反映肝臟損傷，各大指南進(jìn)一步補(bǔ)充將肝臟有中度或以上的纖維化或炎癥壞死作為抗病毒治療的指征。肝組織活檢是目前診斷肝纖維化和肝臟炎癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其有創(chuàng)性和潛在風(fēng)險(xiǎn)，難以在臨床上廣泛應(yīng)用。為發(fā)現(xiàn)這些ALT不升高但需要治療的患者，臨床上亟需一些新的可用于肝臟炎癥診斷和肝纖維化嚴(yán)重程度評估的指標(biāo)，以及時(shí)甄別需要抗病毒治療的CHB患者。

（二）如何對NAs抗病毒治療的療效進(jìn)行評估與監(jiān)測？

HBV DNA水平不僅是決定患者是否進(jìn)行抗病毒治療的重要依據(jù)，同時(shí)也是評價(jià)患者病毒學(xué)應(yīng)答的指標(biāo)。然而，在接受新一代NAs如恩替卡韋或替諾福韋酯治療1年后，患者的HBV DNA轉(zhuǎn)陰率（下降至檢測下限之下）分別為67%和76%。那么，血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰后該如何繼續(xù)進(jìn)行抗病毒療效評價(jià)？雖然NAs藥物能使血清HBV DNA迅速轉(zhuǎn)陰，但若此時(shí)停藥往往會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)反彈甚至病情加重，因此現(xiàn)有指南均推薦對患者進(jìn)行1~3年不等的鞏固治療或長期治療；且對HBeAg陰性的患者要長期治療直至血清HBsAg消失，即患者獲得“臨床治愈”。然而，很少一部分患者可以獲得HBsAg轉(zhuǎn)陰，同時(shí)缺乏其他評估患者停藥風(fēng)險(xiǎn)的可靠指標(biāo)，所以臨床上NAs藥物的停藥指征并不具有可操作性?？紤]到停藥有較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，多數(shù)指南在推薦停藥的同時(shí)強(qiáng)調(diào)了抗病毒治療用藥的長期性。而長期用藥又給CHB患者帶來經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和心理學(xué)上的壓力，對患者依從性也是一個(gè)考驗(yàn)。如何確定這些患者的治療終點(diǎn)以及部分患者是否可以安全停藥，也是極具爭議的臨床問題。

總之，目前CHB的實(shí)驗(yàn)室檢測存在亟需解決的兩大問題：（1）尋找新的用于評估肝臟炎癥和纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)，及早鑒別需抗病毒治療的CHB患者，使其及時(shí)得到治療；（2）尋找新的用于NAs藥物鞏固治療階段評價(jià)患者病毒學(xué)應(yīng)答的指標(biāo)，以反映共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）的存在及活性，為接受NAs鞏固治療的CHB患者提供個(gè)體化的停藥風(fēng)險(xiǎn)指導(dǎo)。

三、近期發(fā)現(xiàn)的CHB相關(guān)新型標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用價(jià)值

（一）用于確定抗病毒適宜人群的新型標(biāo)志物

血清中乙型肝炎核心抗體（抗-HBc）是HBV既往感染和正在感染的重要標(biāo)志。乙型肝炎核心抗原（HBcAg）免疫原性強(qiáng)，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，所以急性HBV感染恢復(fù)后的很長一段時(shí)間內(nèi)抗-HBc都是陽性。臨床常規(guī)開展的抗-HBc檢測只能定性反映是否感染過HBV。最近，夏寧邵團(tuán)隊(duì)開發(fā)了抗-HBc定量檢測試劑。臨床研究表明，血清抗-HBc定量水平與慢性HBV感染自然史的不同時(shí)期有著非常密切的關(guān)系，免疫耐受期抗-HBc水平相對較低，免疫清除期抗-HBc水平較高，而在非活動(dòng)HBsAg攜帶或者低復(fù)制期時(shí)抗-HBc水平很低。此外，ALT正常但可能存在肝臟損傷和炎癥的慢性HBV感染者，其血清抗-HBc水平也更高，提示抗-HBc定量水平與肝臟炎癥狀態(tài)密切相關(guān)^[4]。因此血清抗-HBc定量檢測可以彌補(bǔ)部分因ALT未升高導(dǎo)致的CHB患者漏診。

高爾基體蛋白73（GP73）之前一直被認(rèn)為是肝癌的診斷標(biāo)志物，但我們和其他實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，血清GP73實(shí)際上是一個(gè)反映肝纖維化及肝硬化的標(biāo)志物^[5-6]。近期的一系列研究結(jié)果表明，血清GP73與肝臟炎癥活動(dòng)度具有相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)0.524），可能也是肝臟炎癥的潛在標(biāo)志物。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對于HBeAg陽性或陰性的CHB患者，GP73對中度以上的肝臟炎癥活動(dòng)度的ROC曲線下面積分別為0.782和0.841。通過多因素分析，將適用于肝臟炎癥活動(dòng)度診斷的指標(biāo)如AST、GGT組合，建立肝臟炎癥活動(dòng)的聯(lián)合診斷模型HIM（hepatic inflammation diagnosismodel）。對于中度以上炎癥活動(dòng)度診斷效能ROC曲線達(dá)到0.898。值得強(qiáng)調(diào)的是，這種基于GP73的肝臟炎癥診斷模型的曲線下面積在ALT不升高（即ALT<40）的CHB患者中能達(dá)到0.873，且診斷效能穩(wěn)定^[7]。同期發(fā)表的國內(nèi)另外一項(xiàng)研究也顯示，血清GP73是一個(gè)肝臟炎癥損傷的指標(biāo)，特別在ALT＜2 ULN的患者中，GP73對于中度以上炎癥活動(dòng)度診斷ROC曲線下面積可達(dá)0.806^[8]。據(jù)此我們建議，未來應(yīng)開展更多的臨床研究，在進(jìn)一步完善GP73的肝硬化診斷應(yīng)用的同時(shí)，優(yōu)化基于GP73的肝臟炎癥診斷模型，為ALT不升高的CHB患者肝臟炎癥精準(zhǔn)鑒別提供無創(chuàng)診斷手段。

為進(jìn)一步驗(yàn)證GP73升高與肝臟炎癥活動(dòng)度有關(guān)，我們的研究中納入了一個(gè)抗病毒治療縱向研究隊(duì)列。對該組患者進(jìn)行連續(xù)血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，隨著抗病毒治療后肝臟炎癥的有效控制，血清GP73水平和ALT一樣明顯下降，但GP73的下降在時(shí)相上略有延遲^[7]。這或許間接支持了我們的觀點(diǎn)，GP73是一個(gè)肝臟再生修復(fù)指標(biāo)，即：肝臟炎癥損傷致ALT從肝細(xì)胞釋放入血；為修復(fù)損傷的肝組織，殘存肝細(xì)胞GP73表達(dá)隨即增加，參與代償性肝再生的啟動(dòng)，相對應(yīng)血清GP73水平升高^[9]；隨著病毒復(fù)制被抑制，肝臟的炎癥得到改善，伴隨肝細(xì)胞損傷的緩解，ALT隨即復(fù)常，肝細(xì)胞再生也隨著肝臟的修復(fù)而停止，不再需要GP73高表達(dá)以促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，血清GP73也隨即復(fù)常。我們在該研究中也發(fā)現(xiàn)具有促炎和促肝細(xì)胞再生修復(fù)作用的白細(xì)胞介素6能夠轉(zhuǎn)錄激活GP73的表達(dá)。近期王建設(shè)團(tuán)隊(duì)還探索了GP73測定在兒童不同病因肝病中的診斷應(yīng)用，以肝穿刺病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，在3歲以下兒童中GP73與肝臟纖維化程度及炎癥活動(dòng)度具有相關(guān)性。以臨床使用的肝硬化診斷模型APRI為對照，GP73對于3歲以下兒童的中度以上肝纖維化的診斷能力優(yōu)于APRI^[10]。

（二）用于抗病毒治療療效監(jiān)測和評估的新型標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染者血清中除了Dane顆粒外，還存在HBV RNA病毒樣顆粒（圖2）^[11]。HBV RNA病毒樣顆粒中含有HBV前基因組RNA（pgRNA），在NAs抗病毒治療下其水平能更好地反映肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的存在及轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)^[12]。據(jù)此我們推測，NAs抗病毒治療時(shí)血清HBVDNA和HBV RNA的同時(shí)持續(xù)消失（低于檢測下限）是真正的病毒學(xué)應(yīng)答^[13]。而且，HBV RNA在HBV DNA消失后很長一段時(shí)間內(nèi)仍可以被檢測到^[14]，聯(lián)合HBV DNA和HBV RNA的總核酸檢測也更能反映cccDNA的活性^[15]；張文宏團(tuán)隊(duì)的工作更顯示了抗病毒治療下患者血清HBV RNA水平與肝臟炎癥損傷的相關(guān)性^[12]。因此，研制HBV DNA和HBV RNA的聯(lián)合檢測具有顯著的臨床意義。

圖2 CHB患者血清中存在HBV RNA樣病毒顆粒[11,16]

CHB患者抗病毒治療的理想治療終點(diǎn)是“臨床治愈”，即血清HBsAg消失，伴有或不伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)。但很多研究都發(fā)現(xiàn)，長期用藥、尤其是當(dāng)HBeAg轉(zhuǎn)陰后，血清HBsAg與cccDNA相關(guān)性顯著下降，且低水平HBsAg陽性并不能證明肝臟內(nèi)仍有cccDNA存在^[17]。對于這一現(xiàn)象，目前較為公認(rèn)的解釋是整合于宿主基因組上的HBV DNA片段也能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBsAg^[18]。因此，臨床上亟需新的能真實(shí)反映肝組織cccDNA消失或靜默的指標(biāo)，以判定接受延長鞏固治療的患者是否已經(jīng)獲得“病毒學(xué)治愈”?？煽康?/span>cccDNA檢測技術(shù)對于判定CHB的病毒學(xué)治愈至關(guān)重要。目前，精準(zhǔn)cccDNA檢測的最大挑戰(zhàn)是如何排除松弛環(huán)狀雙鏈DNA（rcDNA）的干擾。由于cccDNA是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pgRNA的唯一來源，而pgRNA又是逆轉(zhuǎn)錄合成病毒rcDNA負(fù)鏈的唯一模板，所以rcDNA的存在不僅間接反映了cccDNA的存在，更提示其處于轉(zhuǎn)錄活躍狀態(tài)。據(jù)此我們認(rèn)為，在檢測患者肝組織內(nèi)是否存在有感染潛能的病毒核酸時(shí)，并不需要區(qū)分rcDNA和cccDNA。但考慮到慢性HBV感染中整合病毒DNA的普遍存在，有必要建立一種能有效區(qū)分有病毒復(fù)制能力的rcDNA/cccDNA與無復(fù)制能力的整合HBV DNA的檢測技術(shù)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，整合HBV DNA片段的斷端主要集中在HBV直接重復(fù)區(qū)（direct repeat，DR）1和DR2附近^[19]，也是HBV 基因組的缺口（Gap）區(qū)1592～1826附近，整合片段斷端的這一特征與雙鏈線性DNA是HBV整合主要來源的報(bào)導(dǎo)相一致。基于整合HBV DNA片段的這些特征，我們建立了一對單跨rcDNA缺口引物，使之能有效擴(kuò)增rcDNA或cccDNA，但由于兩引物在整合的線性HBV DNA片段上的方向相反，故不能擴(kuò)增整合HBV片段^[20]。

血清HBV核心抗原相關(guān)抗原（HBcrAg）包括HBeAg、HBcAg以及分子量為22 kDa的前核心蛋白p22cr，與HBV RNA一樣，只能來源于pgRNA，而pgRNA只能從cccDNA轉(zhuǎn)錄而來，因此HBcrAg能反映肝組織內(nèi)cccDNA的水平和轉(zhuǎn)錄活性，且兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性^[21]。此外，NAs不能直接作用于HBcrAg，所以HBV DNA低于檢測下限后，HBcrAg仍可被檢測。徐東平團(tuán)隊(duì)的最新研究發(fā)現(xiàn)了抗病毒治療時(shí)代患者血清中HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg和HBsAg等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律（圖3）^[14]。目前困惑在于，現(xiàn)有HBcrAg試劑盒的檢出下限卻顯著高于HBeAg檢測試劑。

圖3 NAs治療下患者血清HBV DNA、RNA、HBcrAg和HBsAg動(dòng)態(tài)變化示意圖[14]

需要強(qiáng)調(diào)的是，盡管我們和其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果共同提示，HBV RNA和HBcrAg是目前比較理想的反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的血清學(xué)指標(biāo)，可以很好地用于CHB患者抗病毒治療HBV DNA低于檢測下限后的病毒學(xué)應(yīng)答的監(jiān)測。但血清HBV RNA和HBcrAg是否可作為評估停藥風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)，尚缺乏進(jìn)一步的研究。另外還需要注意，對長期接受抗病毒治療的CHB患者判定其是否達(dá)到病毒學(xué)治愈時(shí)，只有在這些患者血清中有關(guān)HBV的病原學(xué)指標(biāo)均低于檢測下限時(shí)[LH1] [曾2] ，才有行肝臟穿刺術(shù)進(jìn)行肝組織cccDNA檢測的必要。另外，肝穿刺活檢cccDNA檢測也可用于隱匿性HBV感染的診斷。

綜上所述，我們建議：（1）考慮增加抗-HBc定量和血清GP73測定，以在非常規(guī)肝穿刺活檢的情況下，使有明顯肝臟炎癥損傷的患者得到及時(shí)的抗病毒治療，減少肝硬化終末期肝病發(fā)生；另一方面，對于正在接受NAs藥物抗病毒治療的患者，在靈敏試劑檢測血清HBVDNA低于檢測下限后，應(yīng)加測HBVRNA或HBcrAg，以對處于鞏固治療階段的患者病毒學(xué)應(yīng)答進(jìn)行監(jiān)測，并評估鞏固治療后的停藥風(fēng)險(xiǎn)等。作為曾經(jīng)的HBV感染高流行國家，我們在通過乙型肝炎疫苗預(yù)防接種已有效減少新發(fā)感染的同時(shí)，對確診需要治療的CHB患者進(jìn)行精準(zhǔn)的干預(yù)治療，以減少終末期肝病的發(fā)生。

文章來源：《肝臟》雜志第5期

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