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Integrated analysis of singlecell RNAseq and bulk RNAseq unravels tumour heterogeneity plus M2like tumourassociated macrophage infltration and aggressiveness in TNBC

單細(xì)胞RNA-seq和bulk RNA-seq聯(lián)合分析揭示TNBC中腫瘤異質(zhì)性以及M2型腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞侵襲特征

三陰性乳腺癌（TNBC）具有廣泛的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。盡管近年來(lái)乳腺癌治療的有所進(jìn)展，但很大一部分的TNBC患者進(jìn)展到轉(zhuǎn)移階段且臨床表現(xiàn)不佳，通過(guò)消除大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞可能無(wú)法有效抑制TNBC。單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組分析的組合可以表征腫瘤異質(zhì)性和免疫狀況與臨床結(jié)果之間的聯(lián)系，并確定免疫狀況與臨床結(jié)果的關(guān)聯(lián)。

作者首先進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq分析，TAMs相關(guān)基因標(biāo)記被用來(lái)預(yù)測(cè)生存和免疫治療反應(yīng)。UMAP方法用于非線性降維，結(jié)果顯示，每個(gè)患者的腫瘤細(xì)胞高度聚集。

表1 TNBC患者(單細(xì)胞RNA-seq)信息

TNBC的腫瘤復(fù)發(fā)與幾個(gè)侵襲性特征密切相關(guān)，如細(xì)胞干性、血管生成和EMT，因此作者在單細(xì)胞水平上分析了這三個(gè)特征。在TNBC細(xì)胞中，細(xì)胞干性、血管生成和EMT互相呈正相關(guān)。作者還分析了三者中分?jǐn)?shù)均較高的細(xì)胞（散點(diǎn)圖中的紅色標(biāo)記），表明其在腫瘤進(jìn)展，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中潛在的協(xié)同作用。

圖1 TNBC在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性

在UMAP降維下免疫細(xì)胞被分成三組，這三個(gè)集群與免疫細(xì)胞類型(T細(xì)胞，B細(xì)胞，和巨噬細(xì)胞)匹配良好。熱圖顯示了識(shí)別這三個(gè)集群最關(guān)鍵的基因。

圖2腫瘤免疫細(xì)胞亞群聚類

作者下一步分別對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行分析。TNBC中與T細(xì)胞激活和功能狀態(tài)相關(guān)的特征基因集從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中提取，如T細(xì)胞調(diào)節(jié)、共刺激、天然、細(xì)胞毒性和衰竭。結(jié)果顯示，BC09患者比其他患者具有更多的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。相比之下，PT058和PT084患者的細(xì)胞毒性t細(xì)胞活性平均水平較低。具有高細(xì)胞毒活性的T細(xì)胞表達(dá)高水平的CST7、GZMA、GZMB、IFNG、NKG7、PRF1和TNFSF10。此外，TNBC組織中的T細(xì)胞即使在單個(gè)患者中也表現(xiàn)出混合的幼稚T狀態(tài)。幼稚t細(xì)胞狀態(tài)可能與t細(xì)胞在TNBC中的細(xì)胞毒性活性有關(guān)。

圖3 TNBC單細(xì)胞中T細(xì)胞信號(hào)特征

作者也分析了腫瘤相關(guān)B細(xì)胞的功能狀態(tài)，如抗凋亡增殖、相關(guān)基因表達(dá)特征。B免疫細(xì)胞在TNBC患者和同一TNBC患者中表現(xiàn)出異質(zhì)性分布?？偟膩?lái)說(shuō)，通過(guò)單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)， T細(xì)胞和B細(xì)胞在單個(gè)細(xì)胞水平上表現(xiàn)出明顯差異，無(wú)論是在某個(gè)患者還是在不同的患者之間。

圖4 TNBC單細(xì)胞中B細(xì)胞水平特征

總的來(lái)說(shuō)，在TNBC中，M2樣TAMs是巨噬細(xì)胞的主要類型，如下圖。作者在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了高M(jìn)2活性。在多種癌癥類型中，M2樣TAMs通過(guò)誘導(dǎo)血管生成、EMT和干性來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá)的基因也參與炎癥和血管生成功能。M2型基因如TGFBI、MS4A6A和CD163在TNBC的大多數(shù)巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。此外，已知的促進(jìn)血管生成、EMT和腫瘤進(jìn)展的基因，如IL8和PLAUR，在TNBC巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。

圖5 單細(xì)胞水平上整合TNBC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

作者收集TCGA TNBC患者的Bulk-RNA-seq數(shù)據(jù)，利用CIBERSORT算法計(jì)算M2樣TAMs的豐度。TCGA TNBC患者信息匯總見(jiàn)表2。

表2 TNBC患者(bulk RNA-seq)信息

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，TNBC患者中大量的TAMs與較差的無(wú)復(fù)發(fā)生存(RFS)相關(guān)。緊接著作者做了WGCNA分析，共生成7個(gè)非灰色模塊。在這些模塊中，與M2樣TAM分?jǐn)?shù)相關(guān)性最高的藍(lán)色模塊被認(rèn)為是“TAM模塊”。基因顯著性代表了單個(gè)基因與TAM密度的關(guān)聯(lián)，量化了模塊特征值與基因表達(dá)譜之間的相關(guān)性。散點(diǎn)圖表明該模塊與M2型TAMs高度相關(guān)。

圖6 Bulk-RNA seq顯示TNBC患者高TAMs與不良預(yù)后相關(guān)

作者使用PCA方法計(jì)算每個(gè)患者的保護(hù)評(píng)分Anti-TAMpca。Anti-TAMpca保護(hù)評(píng)分根據(jù)各基因表達(dá)水平和PCA評(píng)分計(jì)算。Kaplan-Meier圖顯示，在TCGA TNBC隊(duì)列中，保護(hù)評(píng)分高的患者比保護(hù)評(píng)分低的患者預(yù)后更好。作者基于TAM相關(guān)基因模型的保護(hù)評(píng)分應(yīng)用于GEO外部驗(yàn)證隊(duì)列，Cox回歸分析顯示TAM相關(guān)模型在GEO隊(duì)列中的預(yù)測(cè)價(jià)值。通過(guò)ssGSEA來(lái)確定TAM相關(guān)模型的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)膽汁酸代謝、雌激素反應(yīng)和P53通路與TAM相關(guān)保護(hù)評(píng)分呈高度負(fù)相關(guān)。

研究進(jìn)一步根據(jù)共識(shí)聚類，將TNBC根據(jù)TAM相關(guān)基因特征的表達(dá)模式劃分為不同的亞組。累積分布函數(shù)(CDF)圖顯示了每個(gè)k的共識(shí)矩陣的CDF，量化了共識(shí)矩陣在0到1范圍內(nèi)的分布情況。選擇k = 2作為最優(yōu)參數(shù)，將訓(xùn)練隊(duì)列劃分為不同的亞組。熱圖顯示了兩個(gè)集群之間差異表達(dá)的基因。Kaplan-Meier圖顯示，組1患者的預(yù)后優(yōu)于組2患者。小提琴曲線圖顯示，與第1組相比，第2組TAM評(píng)分顯著升高。在TBNC的第1組和第2組中進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果表明，上調(diào)的通路包括早期雌激素反應(yīng)相關(guān)通路、晚期雌激素反應(yīng)相關(guān)通路、M2巨噬細(xì)胞以及p53通路。下調(diào)的通路包括E2F靶點(diǎn)、G2M檢查點(diǎn)和MYC靶點(diǎn)相關(guān)的通路。

圖7 根據(jù)TAM相關(guān)基因特征進(jìn)行分子亞型鑒定

作者通過(guò)隨機(jī)森林算法和支持向量機(jī)算法均采用了特征重要性排序方法，提取與M2型TAM評(píng)分相關(guān)的前50個(gè)最重要基因并取交集。顯示隨機(jī)森林算法和SVM算法共有的19個(gè)基因，其中VIPR1、ABCD4、SLC40A1和SCN1A是不良預(yù)后因素，其余15個(gè)基因與更好的RFS相關(guān)。

作者建立了一個(gè)基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)框架來(lái)預(yù)測(cè)TAM相關(guān)基因模型對(duì)免疫治療的反應(yīng)。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)框架如圖8所示。TCGA的TNBC隊(duì)列作為訓(xùn)練集，GEO隊(duì)列作為測(cè)試集來(lái)評(píng)估準(zhǔn)確性。在訓(xùn)練過(guò)程中，測(cè)試集的損失值隨著迭代的增加而減小，說(shuō)明訓(xùn)練過(guò)程的效率很高。當(dāng)?shù)鷶?shù)達(dá)到1000進(jìn)行訓(xùn)練時(shí)，使用混淆矩陣對(duì)測(cè)試集中的所有樣本進(jìn)行正確識(shí)別， ROC曲線下面積(AUC)達(dá)到100%。

圖8 基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的深度學(xué)習(xí)框架構(gòu)建TAM相關(guān)基因模型

作者通過(guò)單細(xì)胞RNA-seq和Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，分析了腫瘤細(xì)胞和腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞之間的異質(zhì)性，在單細(xì)胞水平上發(fā)現(xiàn)了血管生成、干性和EMT之間高度相關(guān)，并鑒定出了同時(shí)高表達(dá)的細(xì)胞亞群。在TNBC患者中，M2型TAMs與不良預(yù)后相關(guān)。隨后，作者通過(guò)隨機(jī)森林算法和SVM算法發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與M2型TAMs評(píng)分高度相關(guān)的基因，建立了一個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)預(yù)測(cè)M2型TAMs相關(guān)預(yù)后模型，思路清晰。