1.1 基因組醫(yī)學(xué)為鑒定復(fù)雜疾病的生物標(biāo)志物和可治療靶標(biāo)鋪平了道路，單細(xì)胞RNA測序研究（scRNA-seq）可以表征整個器官中的此類復(fù)雜變化。取而代之的是，在多個細(xì)胞類型的多個因果機制的分散體是通過其他一些研究。這種復(fù)雜性的一個極端后果是可能需要大量的藥物才能有效治療每種疾病。為了解決這個問題，我們理想地需要表征所有與疾病相關(guān)的細(xì)胞類型和途徑，然后優(yōu)先確定相對最重要的細(xì)胞。據(jù)我們所知，這兩個挑戰(zhàn)都沒有得到系統(tǒng)解決。一個原因是患者可能無法獲得許多細(xì)胞類型，另一個原因是缺乏在細(xì)胞類型和途徑之間進(jìn)行優(yōu)先排序的方法。
1.2 作者的策略的普遍適用性通過對151例患有13種自身免疫性，過敏性，感染性，惡性，內(nèi)分泌性，代謝性和心血管性疾病以及53個年齡和性別匹配的對照的患者進(jìn)行的前瞻性診斷研究得到了支持。該策略的治療潛力得到了對這些疾病的基于網(wǎng)絡(luò)的分析以及對關(guān)節(jié)炎小鼠模型的研究的支持。綜上所述，作者的結(jié)果支持我們的策略可能具有優(yōu)先考慮復(fù)雜疾病中治療和診斷目標(biāo)的潛力。
2.1 試驗設(shè)計
2.1.1總而言之，本研究描述了構(gòu)建MCDM并將其用于診斷和治療的可擴展的分步策略。該策略已通過臨床和實驗研究驗證。該策略基于應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)工具來組織和分析來自關(guān)節(jié)炎和人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的scRNA-seq數(shù)據(jù)。使用來自13種疾病的前瞻性臨床研究的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物進(jìn)行診斷驗證研究。通過對關(guān)節(jié)炎小鼠模型的治療研究，使用表型，免疫組織化學(xué)和細(xì)胞分析作為讀數(shù)，檢查了候選藥物。
2.1.2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型
使用bcl2fastq Conversion和Picard軟件將單細(xì)胞數(shù)據(jù)處理為數(shù)字基因表達(dá)矩陣。從GRCh38（2017年4月，Ensembl）獲取用于人類數(shù)據(jù)（和GRCm38（2017年6月，Ensembl）用于小鼠的讀數(shù)的索引參考。使用STAR軟件獲取數(shù)據(jù)。根據(jù)使用STAR軟件的作圖質(zhì)量，在下游分析期間僅考慮了與參考基因組的初步比對。通過每個細(xì)胞至少有10,000個讀數(shù)，400個轉(zhuǎn)錄本和少于20％的線粒體基因來評估細(xì)胞的質(zhì)量。由于存在文庫重復(fù)的風(fēng)險，導(dǎo)致兩個或更多細(xì)胞共享細(xì)胞條形碼，因此，基于對轉(zhuǎn)錄物計數(shù)的高估，可以移除異常值。結(jié)果分別獲得了7086和1333個細(xì)胞用于關(guān)節(jié)和淋巴結(jié)數(shù)據(jù)。然后使用Seurat [34]將單細(xì)胞數(shù)據(jù)歸一化以進(jìn)行進(jìn)一步分析。為了減少數(shù)據(jù)中的噪聲，對每個組織矩陣分別進(jìn)行K最近鄰平滑處理，至少使用5個k，或者如果捕獲到5000個以上的單元，則要占單元總數(shù)的?0.1％。
3.1 抗原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（AIA）小鼠模型的scRNA-seq分析
圖一：抗原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（AIA）小鼠模型的scRNA-seq分析
a AIA鼠標(biāo)模型的概述。b蘇木精和曙紅（H＆E）染色后，來自幼稚小鼠和關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的代表性關(guān)節(jié)圖像。B，骨髓；S，滑膜腔；C，軟骨。箭頭指示（1）炎性細(xì)胞向滑膜的浸潤，（2）軟骨/骨破壞，和（3）滑膜內(nèi)膜的增生。c使用參考成分分析（RCA）對seq-well scRNA-seq和細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定的示意圖。d t-SNE圖顯示7086個健康和RA關(guān)節(jié)細(xì)胞（n = 4個健康小鼠樣品和5個患病小鼠樣品）以及1333個健康和AIA淋巴結(jié)細(xì)胞（n = 4個健康小鼠樣品和5個患病小鼠樣品），由RCA簇著色
3.1來自AIA小鼠模型的多細(xì)胞疾病模型（MCDM）
來自AIA小鼠模型的多細(xì)胞疾病模型（MCDM）
通過將每種細(xì)胞類型中差異表達(dá)的基因與所有其他細(xì)胞類型中預(yù)測的上游調(diào)節(jié)子相連接，基于scRNA-seq數(shù)據(jù)構(gòu)建MCDM。像元類型大小對應(yīng)于中心性得分。節(jié)點指示的數(shù)字表示已識別的特定類型的細(xì)胞數(shù)（例如，在RA關(guān)節(jié)中，我們已識別出4258個粒細(xì)胞）。一個從關(guān)節(jié)炎小鼠的淋巴結(jié)的MCDM。b來自關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的MCDM。c健康小鼠關(guān)節(jié)的多細(xì)胞模型（未顯示淋巴結(jié)模型，因為只有一種預(yù)測的相互作用）。預(yù)測的上游調(diào)節(jié)子的基因名稱顯示在箭頭上。Treg，T調(diào)節(jié)細(xì)胞。d 細(xì)胞類型的中心性評分與通過GWAS鑒定的具有遺傳變異的基因的富集和差異表達(dá)基因之間專家管理的存儲庫之間的相關(guān)性（這些基因來自DisGeNet并基于人類基因的小鼠直向同源物進(jìn)行了分析）
3.3疾病相關(guān)細(xì)胞類型的網(wǎng)絡(luò)模型
疾病相關(guān)細(xì)胞類型的網(wǎng)絡(luò)模型
a24個細(xì)胞類型和亞群均顯著富集與RA相關(guān)GWAS富集后生標(biāo)記。像元類型大小對應(yīng)于關(guān)聯(lián)-ln（p值）。b與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）相關(guān)的細(xì)胞類型的網(wǎng)絡(luò)模型。節(jié)點對應(yīng)于細(xì)胞類型，節(jié)點大小對應(yīng)于關(guān)聯(lián)的重要性（-log10 RA GWAS-表觀遺傳標(biāo)記富集p值）。具有潛在空間相互作用的單元格類型被鏈接在一起，并且單元格類型的位置取決于中心得分，如背景中的圓環(huán)所示。C按與175種人類疾病的關(guān)聯(lián)的重要性排序的細(xì)胞類型類別的條形圖（Fisher結(jié)合了富含GWAS的表觀遺傳標(biāo)記–為每種細(xì)胞類型類別計算的疾病關(guān)聯(lián)p值）。d基于與b中相同的參數(shù)的與175種疾病相關(guān)的細(xì)胞類型的網(wǎng)絡(luò)模型（有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱結(jié)果）
3.4根據(jù)13種疾病的臨床概況研究，CD4 + T細(xì)胞具有診斷潛力。
根據(jù)13種疾病的臨床概況研究，CD4 + T細(xì)胞具有診斷潛力。
疾病模塊的玩具模型。疾病相關(guān)基因（紅色）被映射到人蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)（藍(lán)色）上。共定位的疾病相關(guān)基因形成一個模塊。b基于模塊的分析概述。第一步是在前瞻性CD4 + T細(xì)胞微陣列研究中確定的13種疾病中的每一種的疾病模塊的識別。對于每種疾病模塊，基因?qū)⒒颊吲c健康對照區(qū)分開。為了成對比較疾病，將兩個模塊的結(jié)合中的基因分開患有不同疾病的患者。例如，流感和哮喘模塊中的基因?qū)⒘鞲谢颊吲c患有AUC為0.99的哮喘患者區(qū)分開，p = 3.3×10 -5，如c所示。c使用彈性網(wǎng)基于模塊相交基因在13種疾病分類的曲線下面積（AUC）值上顯示熱圖。d?基于在CD4 + T細(xì)胞中測得的預(yù)先選擇的生物標(biāo)志物（基因），對乳腺癌患者（n = 24）和健康受試者（n = 14）的分類準(zhǔn)確性進(jìn)行的獨立驗證研究。用彈性網(wǎng)進(jìn)行分類，保留與原始研究相同的λ（λ）值。e – j根據(jù)在潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）模塊相交處鑒定出的六種分泌血漿蛋白，對IBD患者進(jìn)行潛在的診斷分類。這些蛋白質(zhì)可以將患者與健康對照（HCs）分開。e CXCL11; f CCL25；g CXCL1; h CXCL8；i IL1B；? TNF。k克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎患者根據(jù)CXCL1和CXCL8的標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分類。UC，潰瘍性結(jié)腸炎；CD，克羅恩病；HC，健康對照。星號表示p值<0.05。d – k方框中的條形圖代表中位數(shù)，第25和第75個百分位數(shù)，而晶須延伸到± 2.7σ（請參見“方法”部分）
3.5苯扎貝特可預(yù)防抗原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（AIA）
苯扎貝特可預(yù)防抗原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（AIA）
用苯扎貝特（n = 4）或模擬（AIA對照，n = 5）腹膜內(nèi)（ip）治療mBSA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的雌性小鼠。一個基于在兩個組的組織病理學(xué)第28天的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性評分（H＆E染色，垂直條表示中值，使用曼-惠特尼評估組間差異的ü測試，* p <0.05）。b來自苯扎貝特治療的小鼠的代表性H＆E聯(lián)合圖像。c從模擬（AIA對照，n = 5）或苯扎貝特治療（n）分離的脾和淋巴結(jié)細(xì)胞中，CD4 +輔助性T細(xì)胞的抗原召回反應(yīng)?= 4）小鼠；豎線表示平均值±SEM，使用雙面Mann-Whitney U檢驗評估的組間差異* p <0.05）
4.1由于成千上萬的基因參與了許多不同的細(xì)胞類型，因此了解復(fù)雜疾病中的致病機制和確定藥物靶標(biāo)是一項艱巨的挑戰(zhàn)。諸如GWAS和scRNA-seq等無偏倚的全基因組方法表明，多種致病機制分散在許多細(xì)胞類型中。
4.2藥物發(fā)現(xiàn)的困難以及為什么許多患者對治療無反應(yīng)。盡管如此，疾病相關(guān)細(xì)胞類型的系統(tǒng)表征和優(yōu)先級以及用于診斷和治療的機制仍未解決。一種明顯的方法是識別并確定最重要的途徑。在作者對AIA的scRNA-seq研究中，發(fā)現(xiàn)涉及T細(xì)胞分化的途徑最為重要。這與對RA發(fā)病機理的當(dāng)前理解是一致的，并已導(dǎo)致靶向此類途徑的藥物。但是，效果是可變的。作者對scRNA-seq數(shù)據(jù)的系統(tǒng)分析提出了一種可能的解釋，該數(shù)據(jù)揭示了每種細(xì)胞類型中的大量其他途徑和治療靶標(biāo)，以及細(xì)胞類型之間的重疊有限。
4.3結(jié)果支持基于網(wǎng)絡(luò)的原理可以同時應(yīng)用于兩者。將來自AIA和人類RA的scRNA-seq數(shù)據(jù)整理成MCDM。取代任何具有明顯關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的獨特細(xì)胞類型或機制，MCDM中的大多數(shù)細(xì)胞類型都相互作用，形成了多向網(wǎng)絡(luò)，其中多種細(xì)胞類型可能導(dǎo)致了發(fā)病機理。盡管一種細(xì)胞類型和機制可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，但對遺傳和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)的分析支持致病機制分散在多種細(xì)胞類型中。
4.4作者發(fā)現(xiàn)支持MCDM和網(wǎng)絡(luò)原理可能具有優(yōu)先考慮細(xì)胞類型以及生物標(biāo)志物和藥物發(fā)現(xiàn)機制的潛力。提供了所有提供的數(shù)據(jù)和方法以促進(jìn)此類研究。
-----在讀博士，代謝，組學(xué)研究 王平寫作，歡迎關(guān)注轉(zhuǎn)發(fā)，興趣不斷，學(xué)習(xí)不斷。
Gawel, Danuta R et al. “A validated single-cell-based strategy to identify diagnostic and therapeutic targets in complex diseases.” Genome medicine vol. 11,1 47. 30 Jul. 2019, doi:10.1186/s13073-019-0657-3
聯(lián)系客服
