編譯：小范兒，編輯：小菌菌、江舜堯。
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導(dǎo)讀
已建議對(duì)早產(chǎn)兒口服益生菌防止壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）。然而，益生菌對(duì)內(nèi)源性微生物群的影響還沒有完全被了解。
該文章進(jìn)行了一項(xiàng)觀察性研究，包括80例胎齡小于32周的早產(chǎn)兒，描述不處理或口服兩種不同益生菌配方后益生菌的持久性，在干預(yù)期間和干預(yù)后對(duì)微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響及其與NEC發(fā)育的關(guān)系。
每周的糞便樣本用16S rRNA測(cè)序進(jìn)行分析，并用定量PCR檢測(cè)益生菌的存在。對(duì)照組和兩個(gè)益生菌組之間的菌群分布有顯著差異。補(bǔ)充益生菌與較低的時(shí)間變化以及較高的雙歧桿菌和腸桿菌相對(duì)豐度相關(guān)，同時(shí)減少大腸桿菌、腸球菌和克雷伯氏菌的豐度。在大約50%的嬰兒中觀察到益生菌雙歧桿菌定殖，盡管它在大多數(shù)情況下是短暫的。添加益生菌的新生兒NEC發(fā)病率明顯降低。結(jié)果表明，益生菌可以成功地實(shí)現(xiàn)短暫定殖，并對(duì)內(nèi)源性微生物群產(chǎn)生顯著影響，減少與NEC發(fā)育相關(guān)的細(xì)菌類群的豐度。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)益生菌的補(bǔ)充可能允許有針對(duì)性的操縱腸道微生物群，并帶來臨床效益。
原名：Influence of probiotic supplementation on the developing microbiota in human preterm neonates譯名：補(bǔ)充益生菌對(duì)早產(chǎn)兒微生物群發(fā)育的影響通訊作者：Mathias W. Hornef & JohnPenders
通訊作者單位：德國亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物研究所Search Results
Web results那不勒斯腓特烈二世大學(xué)
作為縱向觀察性研究的一部分，我們收集2016年1月至2018年每周在亞琛工業(yè)大學(xué)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院的早產(chǎn)兒的糞便。2016年1月至2016年5月，對(duì)孕齡小于32周的新生兒每日補(bǔ)充益生菌，包括嗜酸乳桿菌(ATCC 4356)和長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種(ATCC 15697)，隨后被稱為嬰兒雙歧桿菌。2016年5月，該益生菌不再商業(yè)化供應(yīng)，不得不停止補(bǔ)充(對(duì)照組)。2017年1月起，由嗜酸乳桿菌La-14 (ATCC SD5212)、長(zhǎng)雙歧桿菌亞種longum Bl-05 (ATCC SD5588)組成的另一種益生菌混合物隨后被稱為B.lactis(益生菌2 [P2]組)引入并給予早產(chǎn)兒。兩種益生菌產(chǎn)品的補(bǔ)充持續(xù)到月經(jīng)后36周。從80例早產(chǎn)兒中選擇174份糞便樣本。對(duì)照組、P1組和P2組早產(chǎn)兒的中位孕周分別為29、30和26周，新生兒多為剖宮產(chǎn)。為進(jìn)行組間比較分析(P1組、P2組和對(duì)照組)，將樣本按以下四個(gè)年齡窗進(jìn)行聚類:出生后第1周，第3–4周，第7–9周和第10–12周分別對(duì)應(yīng)于補(bǔ)充益生菌的“之前”（T0），“期間”（T1），“之后”（T2）和“之后很長(zhǎng)時(shí)間”（T3）（圖1a）。通過V3-V4 16SrRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序?qū)S便樣本進(jìn)行分析。隨后，評(píng)估益生菌給藥如何隨時(shí)間（T1-T3）影響特定的內(nèi)源細(xì)菌類群。定量監(jiān)測(cè)停藥后益生菌的定殖和存活能力。1 益生菌的補(bǔ)充會(huì)影響生命早期的微生物群組成
為了評(píng)估新生兒腸道微生物組的總體組成差異，通過V3-V4 16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序?qū)S便樣本進(jìn)行分析。經(jīng)過質(zhì)量過濾后，每個(gè)樣品總共保留7,708,120個(gè)序列，中位數(shù)為21,113個(gè)（范圍為7,727-72,816個(gè)）讀數(shù)，并分配給4,981個(gè)擴(kuò)增子序列變體（ASV）以進(jìn)行后續(xù)分析。糞便中微生物的豐富度隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加（對(duì)照組，P1和P2組分別線性回歸p <0.0001，p = 0.01和p = 0.0021），但對(duì)照組和益生菌組之間無顯著差異（圖1b）。正如預(yù)期的那樣，在開始補(bǔ)充益生菌（T0）之前，三組之間的總體微生物群落組成沒有顯著差異。相反，在補(bǔ)充益生菌時(shí)，對(duì)照組和兩個(gè)益生菌組之間的微生物組成存在顯著差異（圖1c）。在鑒定和糾正潛在的混雜因素（如進(jìn)食類型，敗血癥，抗生素的使用和胎齡）后，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化仍然存在。值得注意的是，從分析中去除所有益生菌特異性ASV后，對(duì)照組和兩個(gè)益生菌組之間也存在顯著差異。這表明觀察到的變化不僅是通過口服益生菌補(bǔ)充劑添加到腸道菌群中的直接結(jié)果。此外，與對(duì)照組的嬰兒相比，在T1接受益生菌補(bǔ)充的新生兒個(gè)體間差異較小，因此菌群組成更均一（圖1d）。雖然在隨后的時(shí)間點(diǎn)沒有檢測(cè)到后一種影響，但在停止益生菌補(bǔ)充后，短期(T2)和長(zhǎng)期(T3)內(nèi)，全身微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著差異仍然存在(圖1e & f)。與對(duì)照組相比，兩個(gè)益生菌組在補(bǔ)充益生菌（T1）期間收集的樣品與兩個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)（T2和T3）之間的Bray-Curtis差異均顯著較低（圖1g，h）。表明補(bǔ)充益生菌可減少時(shí)間成分變化，并導(dǎo)致更穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)。
2 益生菌給藥對(duì)內(nèi)源性微生物群的特定分類群有影響隨后，評(píng)估益生菌給藥如何隨時(shí)間（T1-T3）影響特定的內(nèi)源細(xì)菌類群。首先，確定解釋整個(gè)菌群結(jié)構(gòu)中大多數(shù)變異的菌屬是如何與益生菌給藥相關(guān)的。克雷伯菌、大腸埃希菌、雙歧桿菌、腸球菌和腸桿菌是推動(dòng)三組微生物群落結(jié)構(gòu)分離的主要菌屬。通常在未添加益生菌的新生兒中發(fā)現(xiàn)克雷伯菌的含量增加。相比之下，接受P2治療的新生兒的特征是腸桿菌豐度較高，大腸桿菌豐度較低(圖2a)。在接受P1的新生兒中，最常見的是雙歧桿菌和腸球菌的相對(duì)數(shù)量增加。其次，這5個(gè)屬的分類學(xué)隨時(shí)間的變化表明，益生菌的補(bǔ)充減少菌群組成的時(shí)間波動(dòng)。在對(duì)照組中，腸球菌，大腸埃希菌和克雷伯菌的含量很高，而在補(bǔ)充益生菌的新生兒中可以觀察到更穩(wěn)定的模式（圖2b）。這種更穩(wěn)定的模式伴隨著P1組中雙歧桿菌屬的擴(kuò)張和P2組中腸桿菌屬的擴(kuò)張。最后，線性判別分析顯示，雙歧桿菌是所有時(shí)間點(diǎn)接受P1的新生兒中最富集的屬，而乳酸桿菌僅在T1時(shí)顯著富集（圖2c-e）。此外，盡管與P1相似的第二種益生菌在T3處與較高的雙歧桿菌豐度和克雷伯氏菌水平相關(guān)，但這些新生兒在所有時(shí)間點(diǎn)都有較高的腸桿菌豐度，這是與對(duì)照組最顯著的區(qū)別(圖2f-h)。值得注意的是，接受P2治療的新生兒在T1和T2-T3時(shí)，腸球菌和大腸桿菌的含量顯著下降。此外，在兩個(gè)益生菌組中，益生菌配方之外的雙歧桿菌物種豐度與對(duì)照組新生兒相比均有所提高。為了定量監(jiān)測(cè)停藥后益生菌的定殖和存活能力，建立菌種特異性qPCRs檢測(cè)給藥益生菌。qPCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，與對(duì)照組相比，新生兒接受P1處理后B.longum/B. infantis and L. acidophilus 豐度明顯更高。接受P2處理后B. longum/B. infantis, B. lactis, L.acidophilus, and L. casei豐度明顯更高（圖3a-1）。B. longum/B. infantis T2時(shí)仍富集，即停止P1補(bǔ)充后，而 B. lactis and L. acidophilus在停止補(bǔ)充P2 (T2)后仍然增加。重要的是，益生菌不會(huì)永久定殖，因?yàn)樵赥3時(shí)未觀察到益生菌與對(duì)照組之間的顯著差異。但是，在某些（4/11）在T3接受P2的嬰兒中仍可檢測(cè)到乳酸桿菌（圖3f）。圖3 益生菌給藥與益生菌種類檢測(cè)的聯(lián)系。
為了進(jìn)一步調(diào)查益生菌的性質(zhì)和持續(xù)時(shí)間，分析16例新生兒在停止補(bǔ)充益生菌期間和停止補(bǔ)充益生菌20周后每周收集的糞便樣本。將新生兒分為“持久地”定殖，“短暫地”定殖與不定殖。因此，研究表明P1 (B. infantis)中的益生菌雙歧桿菌在停用后會(huì)持續(xù)在大多數(shù)兒童的腸道中定居，而P2中的B. longum的這一比例則有所下降(圖4 a-b)。另一方面，幾乎所有接受P1的新生兒都沒有嗜酸乳桿菌，而在大多數(shù)接受P2補(bǔ)充的新生兒中，嗜酸乳桿菌仍然存在(持續(xù)或短暫)(圖c4 -d)。添加P2的新生兒中也表現(xiàn)B. lactis和干酪乳桿菌的持續(xù)存在，但大多數(shù)新生兒對(duì)這些益生菌的檢測(cè)呈陰性(圖4e-f)。在一些兒童中，雙歧桿菌和干酪乳桿菌的定殖在停止益生菌補(bǔ)充后持續(xù)長(zhǎng)達(dá)15周。4 豐富的病菌和預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎由于這些變化可能會(huì)對(duì)改變的微生物群的不良影響起到保護(hù)作用，接下來研究補(bǔ)充益生菌對(duì)壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)發(fā)生率的影響以及臨床相關(guān)抗菌藥物耐藥性(AMR)基因的存在。盡管在我們的研究期間NEC的總體發(fā)生率較低(n = 10)，但與對(duì)照組相比，補(bǔ)充P1或2的新生兒的發(fā)病率顯著降低(圖5a)。值得注意的是，在沒有NEC的新生兒中只有低含量的腸球菌，從T2年的對(duì)照組中可以看出，克雷伯菌是最主要的類群(圖2b)。為了進(jìn)一步闡明益生菌在此的作用，考慮到數(shù)據(jù)的組成性質(zhì)，進(jìn)行SparCC相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析。有趣的是，補(bǔ)充雙歧桿菌和乳桿菌的益生菌均與NEC-病原菌腸球菌的含量有關(guān)。在接受P1的新生兒中，雙歧桿菌和乳桿菌呈正相關(guān)。乳酸桿菌又表現(xiàn)出與腸球菌的直接負(fù)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性（圖5b）。在接受P2的新生兒中，雙歧桿菌和乳桿菌與腸桿菌呈正相關(guān)，而腸桿菌又與NEC-病原性腸球菌呈負(fù)相關(guān)（圖5c）。由于給藥益生菌可降低早產(chǎn)兒腸球菌、大腸桿菌和克雷伯菌豐度(圖2c-h)，益生菌還可降低耐藥菌株的流行率。耐藥菌株的存在嚴(yán)重阻礙感染事件中有效的抗菌治療。腸球菌可以帶有vanA和vanB抗性基因，賦予對(duì)糖肽抗生素（例如萬古霉素和替考拉寧）的抗性。腸桿菌科，例如大腸埃希菌和克雷伯菌，可以編碼廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），賦予大多數(shù)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥性。因此，我們調(diào)查了vanA和vanB以及最普遍的ESBL（CTX-M組1、2和9）基因的存在。然而，通過添加益生菌，這些抗生素抗性基因的發(fā)生率并沒有顯著改變，這可能是由于所分析人群的腸道菌群中抗生素抗性基因的總體存在率較低。圖5 攝入益生菌可通過干擾病理細(xì)菌預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎。
通過每周的糞便采樣和臨床監(jiān)測(cè)，我們的研究是一項(xiàng)縱向觀察研究，分為三組，一組未接受治療的兒童(對(duì)照組)和兩組接受兩種不同益生菌補(bǔ)充劑(P1和P2)的兒童。盡管不同組在連續(xù)的時(shí)間段內(nèi)取樣，但納入研究的所有患者的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療護(hù)理方案(除補(bǔ)充益生菌外)、醫(yī)療和護(hù)理人員以及新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)環(huán)境和醫(yī)療設(shè)備均相同。值得注意的是，連續(xù)時(shí)間周期的微生物群落結(jié)構(gòu)分析沒有發(fā)現(xiàn)明顯的季節(jié)效應(yīng)或NICU環(huán)境中益生菌菌株或細(xì)菌的交叉污染。與之前在成人和嬰兒中進(jìn)行的許多研究相反，我們顯示幾種益生菌株在停止補(bǔ)充時(shí)的持久性。給予嬰兒B. infantis停止用藥后，大約四分之三的新生兒持續(xù)服用3-15周，然而，觀察到的乳酸菌菌株的持久性較少。與乳酸菌相比，雙歧桿菌這種優(yōu)越的持久性也在其他一些研究中被觀察到。這種差異持久性的機(jī)制很大程度上尚不清楚，但腸道環(huán)境、給藥菌株的特征以及它們的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性可能都有影響。有趣的是，我們檢測(cè)到兩個(gè)補(bǔ)充益生菌配方之間益生菌細(xì)菌豐度的差異，這表明物種或品系差異或共同施用的益生菌菌株的影響。例如，與對(duì)照組的新生兒相比，接受P2的新生兒在停止補(bǔ)充后，B. lactis 而非 B. longum仍顯著富集。此外，與補(bǔ)充P1的新生兒相比，接受P2的新生兒嗜酸桿菌持續(xù)存在。先前的報(bào)道表明母乳具有促進(jìn)雙歧桿菌作用。這種效應(yīng)在很大程度上是由母乳低聚糖(HMOs)驅(qū)動(dòng)的，HMOs是一種結(jié)構(gòu)多樣的未共軛聚糖，在母乳中含量很高，但在配方奶粉中卻不存在。HMOs起著益生元的作用，并促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)。母乳喂養(yǎng)也可能因此促進(jìn)以益生菌形式施用的雙歧桿菌菌株的定殖。這可以解釋所施用的益生菌嬰兒雙歧桿菌菌株的明顯定殖，這是我們研究中已知的HMOs利用者。雖然本研究中研究人群的規(guī)模不能分析母乳喂養(yǎng)和益生菌定殖功效之間的可能聯(lián)系，但未來的調(diào)查應(yīng)該解決這個(gè)有趣的和臨床相關(guān)的問題。即使在從測(cè)序數(shù)據(jù)中去除益生菌的ASVs后，給藥益生菌顯著改變了腸道菌群的組成。因此，給藥益生菌直接或間接影響內(nèi)源性菌群，這與其他研究的結(jié)果一致。最值得注意的是，雖然細(xì)菌豐富度和多樣性未受影響，益生菌的處理顯著減少個(gè)體間的變異和時(shí)間微生物群的變化。新生兒，特別是早產(chǎn)兒，在出生后早期表現(xiàn)出較高的個(gè)體間差異和腸道微生物群組成的重大波動(dòng)。較高的個(gè)體變異和成分波動(dòng)可能導(dǎo)致抗逆性和定植抗性下降，因此更穩(wěn)定的微生物群組成可能保護(hù)免受致病成分變化的影響。此外，早產(chǎn)菌群通常由病理細(xì)菌主導(dǎo)，如大腸桿菌、腸桿菌和克雷伯氏菌，它們產(chǎn)生有效的免疫調(diào)節(jié)分子，如內(nèi)毒素和菌毛，并經(jīng)常攜帶賦予抗生素耐藥性的基因。減少這些細(xì)菌可能會(huì)降低不適當(dāng)?shù)难装Y或全身感染的風(fēng)險(xiǎn)。在這方面，未補(bǔ)充益生菌的早產(chǎn)兒中，克雷伯菌是推動(dòng)全身微生物結(jié)構(gòu)的主要細(xì)菌之一，但在補(bǔ)充益生菌的兒童中，克雷伯菌對(duì)整體微生物結(jié)構(gòu)沒有貢獻(xiàn)。這一觀察結(jié)果與Alcon-Giner及其同事的研究結(jié)果一致。如預(yù)期的那樣，補(bǔ)充益生菌可導(dǎo)致雙歧桿菌和乳酸菌富集。然而，這并不局限于益生菌雙歧桿菌和乳酸菌種類的富集。根據(jù)另一份最新報(bào)告，益生菌雙歧桿菌物種的施用促進(jìn)了內(nèi)源性雙歧桿菌物種的生長(zhǎng)，例如短雙歧桿菌，雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌。根據(jù)另一最新報(bào)告，益生菌雙歧桿菌物種的施用促進(jìn)內(nèi)源性雙歧桿菌物種例如短雙歧桿菌，雙歧雙歧桿菌和動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)。屬內(nèi)物種之間的交叉進(jìn)食或腸道環(huán)境的誘導(dǎo)適應(yīng)可能對(duì)此有所幫助。相比之下，益生菌治療的嬰兒的病原體如克雷伯菌或大腸埃希氏菌以及梭菌和腸球菌減少。這些結(jié)果在很大程度上是一致的，盡管與其他研究中所描述的觀察結(jié)果并不相同。盡管腸球菌和腸桿菌科（克雷伯菌和大腸埃希菌）的數(shù)量減少，但在補(bǔ)充益生菌的新生兒中，編碼萬古霉素抗性和ESBLs的基因的患病率并未降低。這些發(fā)現(xiàn)與先前的研究形成對(duì)比，先前的研究觀察到非益生菌早產(chǎn)兒的糞便中有ESBL基因，而經(jīng)益生菌治療的早產(chǎn)兒則沒有。先前的臨床和動(dòng)物研究表明，腸道微生物群與未成熟的粘膜組織共同參與NEC的病因。因此，在疾病發(fā)生之前，微生物群組成的變化是可以預(yù)料的。對(duì)出生后定期對(duì)早產(chǎn)兒進(jìn)行取樣的一些人類隊(duì)列研究報(bào)告健康嬰兒和NEC嬰兒的腸道微生物群組成。但是，沒有發(fā)現(xiàn)明確預(yù)測(cè)疾病發(fā)作的特定病原體，病原體或微生物群特征。值得注意的是，研究期間幾乎所有記錄的NEC病例都發(fā)生在對(duì)照組的新生兒中，證實(shí)補(bǔ)充益生菌具有顯著的保護(hù)作用。對(duì)于三名NEC患者，在疾病發(fā)作之前可以連續(xù)取樣。這三者在疾病發(fā)作之前均表現(xiàn)出腸球菌豐度的顯著提高。在其他研究中，腸球菌或與腸球菌相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇也增加。此外，在一個(gè)嚙齒類NEC模型中，某些糞腸菌菌株已被證明會(huì)增加組織病理學(xué)。本研究中的兩名患者也表現(xiàn)出克雷伯氏菌豐富度增強(qiáng)，在幾項(xiàng)研究中，克雷伯氏菌與NEC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。此外，NEC發(fā)病前腸桿菌科的豐度有所增加。與預(yù)期的一樣，腸桿菌科成員(Escherichia和Klebsiella)的豐度也在NEC誘導(dǎo)的腸道炎癥中增加。盡管益生菌預(yù)防NEC的機(jī)制尚不清楚，但我們的結(jié)果與其想法相符?？赡馨c微生物群對(duì)外源刺激的適應(yīng)力增強(qiáng)，病原體的減少或?qū)λ拗靼l(fā)育中的腸組織和粘膜免疫系統(tǒng)的間接免疫調(diào)節(jié)作用。
考慮到新生兒腸道內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)估計(jì)為106-1012，因此每天要補(bǔ)充109種細(xì)菌。鑒于早產(chǎn)兒的腸道組織和粘膜免疫系統(tǒng)不成熟，對(duì)全身細(xì)菌感染的敏感性很高，因此需要仔細(xì)考慮口服活菌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。早產(chǎn)兒因口服益生菌引起全身感染的病例已被報(bào)道。在本研究中，未觀察到在研究期間服用益生菌的不良反應(yīng)或感染。綜上所述，我們的結(jié)果表明口服益生菌對(duì)全身微生物群落結(jié)構(gòu)和特定類群的豐度有顯著影響。該數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)腸道菌群建立的獨(dú)特的嬰兒期，并建議補(bǔ)充益生菌對(duì)早產(chǎn)兒有益。
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