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編譯：Peragh，編輯：謝衣、江舜堯。

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本實驗采用共培養(yǎng)設(shè)計方案研究無菌銅綠微囊藻與水生微生物之間的相互作用（圖1A）。無菌透析纖維素膜管能夠分離銅綠微囊藻和湖水微生物群落，起到防止銅綠微囊藻和自然產(chǎn)生的微生物種群之間的細(xì)胞接觸并且允許小分子化合物通過透析膜滲出的作用。在培養(yǎng)之前，將水生微生物和銅綠微囊藻進(jìn)行離心并用超純水多次清洗，然后在改性BG-11培養(yǎng)基（NaNO₃，10mg/L；K₂HPO₄，1mg/L）中培養(yǎng)1d，使其適應(yīng)本實驗共培養(yǎng)體系中的實驗條件。通過三組實驗觀察銅綠微囊藻及其相關(guān)水生微生物的生長情況。（i）對于共培養(yǎng)組，將裝有180 ml銅綠微囊藻培養(yǎng)物（Treat Ma）的無菌透析袋浸入900 ml水生微生物培養(yǎng)基（Treat aM）中，并在2000 ml滅菌玻璃燒杯中共培養(yǎng)。（ii）對照組1，將裝有180毫升銅綠微囊藻培養(yǎng)物的透析袋（銅綠微囊藻對照組，Con-Ma）浸入900毫升含銅綠微囊藻的培養(yǎng)基中。因為共培養(yǎng)組在透析袋外加入900毫升水生微生物，所以在單培養(yǎng)組也加入900毫升銅綠微囊藻培養(yǎng)液浸泡透析袋，以保持培養(yǎng)條件與共培養(yǎng)組一致。僅從180毫升透析袋中收集分析用樣品。（i i i）對于對照組2（類似于對照組1），將裝有180 ml含水生微生物培養(yǎng)基的透析袋浸入900 ml水生微生物培養(yǎng)物中（即水生微生物對照組[Con AM]）。

1銅綠微囊藻與微生物生長狀態(tài)

從圖1B可以看出，在共培養(yǎng)3天后，實驗組680nm處的光密度（OD₆₈₀）和銅綠微囊藻細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組。然而，處理AM組（即用水生微生物處理）的OD₆₈₀和葉綠素a（Chl-a）水平顯著低于對照AM組（圖1C）。此外在共培養(yǎng)過程中，處理組的溶解氧（DO）和pH值顯著低于對照組（圖2）。由于密集的微囊藻種群可以通過夜間呼吸和死亡細(xì)胞的微生物分解會消耗氧氣，所以導(dǎo)致水中供氧不足，無法支持需氧微生物和高等生物的需氧量。同時二氧化碳濃度的增加將無機(jī)碳平衡從碳酸鹽轉(zhuǎn)移到碳酸氫鹽，從而降低pH值，進(jìn)而抑制一些微生物種群的生長。此外對死亡細(xì)胞的分解也會導(dǎo)致實驗組的耗氧量增加（圖2）。本實驗還研究了各組的電導(dǎo)率(EC)隨溶解材料的類型和數(shù)量的變化，與對照組相比，共培養(yǎng)3天和6天后，對照組的電導(dǎo)率明顯上升。值得注意的是，這些水質(zhì)參數(shù)(圖2)，特別是pH值，在單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)系統(tǒng)之間存在顯著差異，這表明水中的這些理化變化直接或間接地受到銅綠微囊藻代謝以及相關(guān)微生物群落的影響。

2培養(yǎng)基中釋放的N、P和MCs的變化

氮和磷的有效性是控制初級生產(chǎn)力和氰化赤潮動態(tài)的關(guān)鍵因素。在本研究中，共培養(yǎng)1天和2天時，實驗組中的總磷(TP)和DIP濃度低于對照組中的總磷和DIP濃度，而在共培養(yǎng)3-8天后，實驗組中的總磷和DIP濃度高于對照組中的總磷和DIP濃度(圖3A)。當(dāng)總磷濃度過低不能滿足藻類生長需要時，許多藻類可以合成堿性磷酸酶(AKP)將DOP水解成DIP。與之前的研究一致，在共培養(yǎng)2和4天后，實驗組的AKP顯著增加，然而AKP隨著DIP的增加而減少(圖3C)。這些結(jié)果表明，銅綠微囊藻對生物體代謝產(chǎn)物中DOP的清除能力很強(qiáng)。隨著銅綠微囊藻的生長，實驗組中的硝酸鹽氮(NO₃-N)濃度也遠(yuǎn)高于對照組(圖3B)。這是由于銅綠微囊藻在共培養(yǎng)系統(tǒng)中對一些伴生物種的生長產(chǎn)生了負(fù)面影響，導(dǎo)致死亡細(xì)胞釋放氮源，同時水生微生物的減少也降低了氮源的消耗。這為銅綠微囊藻的生長提供了一個現(xiàn)成的氮源，這可能在一定程度上解釋了為什么銅綠微囊藻在實驗組條件下的生長優(yōu)于對照組。銅綠微囊藻在共培養(yǎng)條件下生長更好的原因可能有多種，包括互利代謝物(如維生素)的交換、CO₂的補(bǔ)充以及營養(yǎng)物質(zhì)和必需金屬的交換。實驗組中銅綠微囊藻比對照組中生長更快，而且能夠產(chǎn)生大量的MCs釋放到培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)3天后，實驗組的MCs含量顯著高于對照組(圖3D)。且大量研究表明MCs對某些微生物是有毒的，我們的數(shù)據(jù)也表明MCs會導(dǎo)致水生微環(huán)境中浮游植物總量減少(見圖7a)。

3共培養(yǎng)條件下水生微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化

微生物群落多樣性是基于OTUs水平進(jìn)行計算的。Shannon和Simpson指數(shù)反映了群落的多樣性和均勻性，ACE和Chao1指數(shù)反映了物種的豐富度。在第4天和第8天的時候，與對照組相比實驗組中的ACE和Chao1指數(shù)都呈下降趨勢，在第八天的時候Shannon和Simpson多樣性指數(shù)也稍微下降，表明細(xì)菌群落的豐度和多樣性都下降。表1顯示了樣本中觀察到的物種數(shù)量，表中對照組各項數(shù)據(jù)的數(shù)值較高也證明了其物種豐度和多樣性高于實驗組。占主導(dǎo)地位的藍(lán)藻生物量的變化會影響微生物種群的組成和功能，而競爭性排斥往往會導(dǎo)致其他物種豐度的減少，所以更容易在藻華期間“放牧”初級生產(chǎn)者。主坐標(biāo)分析(PCoA)表明，PC1(第一主成分)和PC2(第二主成分)解釋83.89%物種組成的變化(圖4）。共培養(yǎng)的模式可能構(gòu)成PC1的主要部分，因為它導(dǎo)致實驗組和對照組的樣品在培養(yǎng)4和8天后分離，而營養(yǎng)狀況、pH、捕食等環(huán)境因素可能構(gòu)成PC2且在培養(yǎng)的一定時間內(nèi)(4 ~ 8天)會影響OTUs的組成。如圖4B所示，前兩個冗余分析(RDA)軸的特征值解釋了總變化的67.42%。RDA得分顯示環(huán)境變量與這四個群體之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。對照組中第四天和第八天的樣品與EC、DO、pH、NO₃-N呈正相關(guān)。實驗組中第四天和第八天的樣品聚在一起并且與MCs和DIP的相關(guān)性最高。

細(xì)菌群落分析表明，實驗組和對照組在第4天和第8天時，綱水平上微宇宙中的微生物群落均以藍(lán)藻、α蛋白細(xì)菌、β蛋白細(xì)菌和鞘氨醇細(xì)菌為主(圖4C)，而其他類的微生物所占比例均不超過1%。實驗組和對照組中藍(lán)藻(>50%)均是優(yōu)勢類群，在第4天和8天時藍(lán)藻豐度排名前4位的是偽魚腥藻、平裂藻、湖生藍(lán)絲藻和Arronema gygaxiana UTCC393(圖4D)。有趣地是，除偽魚腥藻外，實驗組（第8天）的水生微宇宙中藍(lán)藻的豐度顯著低于對照組（第8天）。一些淡水細(xì)菌的生長已被報道與藍(lán)藻水華有關(guān)，但浮游植物門水平上的物種如變形桿菌，類桿菌和放線菌的豐度基本不變。與銅綠微囊藻共培養(yǎng)后，α蛋白細(xì)菌和β蛋白細(xì)菌顯著增加，鞘氨醇細(xì)菌減少，說明某些細(xì)菌的豐度受到銅綠微囊藻生物量增加的影響。此外，與銅綠微囊藻共培養(yǎng)擾亂了稀有微生物的組成(相對豐度為>1%)，稀有微生物在共培養(yǎng)8天后相對豐度降低或消失。

4共培養(yǎng)條件下真核微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化。

第4天到地8天，對照組中物種多樣性和豐度的下降表明真核生物數(shù)量隨著時間的推移而減少(表2)，實驗組中物種多樣性和豐富度沒有表現(xiàn)出下降的趨勢，但與對照組組相比，在第4和8天時，實驗組群落的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)以及Shannon和Simpson多樣性指數(shù)都有下降的趨勢。這些發(fā)現(xiàn)表明共培養(yǎng)降低了真核物種的多樣性和豐富度。PCoA結(jié)果顯示，PC1和PC2解釋了92.03%的β多樣性(圖5A)。對照組（4天）和實驗組（4天）的坐標(biāo)被PC1分離，對照組（8天）和實驗組（8天）受到PC2的影響更嚴(yán)重。共培養(yǎng)4d的變化可能受銅綠微囊藻的影響，pH、溶解氧等理化水質(zhì)參數(shù)的變化，也可能與共培養(yǎng)8d有關(guān)。在真核生物群落中鑒定出了許多不同的物種，包括一些假菌界物種，如纖毛蟲和褐藻門；后生動物，如輪蟲；病原菌如鏈霉菌；真菌如隱孢子門、子囊菌門和雙核菌亞界(圖5B)。真核生物之間在捕食、競爭關(guān)系和寄生等方面存在相互關(guān)系。在對照組中，輪蟲是最豐富的真核分類群，第4天和第8天分別占對照組真核序列的29.88%和43.81%。輪蟲通常是非?；钴S的食草動物，會影響浮游植物的生物量和豐富度。與對照組相比，實驗組在共培養(yǎng)4天和8天后輪蟲的相對豐度分別下降到8.00和23.45，纖毛蟲成為實驗組中最豐富的真核生物。作為消費者，輪蟲和纖毛蟲在捕食和營養(yǎng)競爭方面是相互聯(lián)系的。我們的研究表明，有毒水華對這些活躍的食草動物的組成有更大的影響，所以這也會改變他們的飲食對象 。在實驗組中其他真核生物，如隱孢子門、鏈孢菌門、子囊菌門和脊索動物門在共培養(yǎng)后減少。此外與對照組相比，實驗組中稀有微生物更接近坐標(biāo)軸，表明稀有微生物減少或完全消失(圖5C)。而稀有微生物和常見類群之間的協(xié)同作用也可能在維持真核生物群落的穩(wěn)定及其生態(tài)功能方面發(fā)揮核心作用。

 5在共培養(yǎng)和單培養(yǎng)體系中銅綠微囊藻和水生微宇宙中的代謝反應(yīng)。

為了闡明銅綠微囊藻對微宇宙中群落影響的潛在機(jī)制，我們檢測了銅綠微囊藻和微宇宙中代謝產(chǎn)物的變化，共鑒定出239種代謝物，PCoA和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的得分圖表明，實驗組和對照組中的微宇宙體系和銅綠微囊藻沿PC1線微明顯的分離(圖6A)。在多變量統(tǒng)計分析中，通過計算組間變量重要性(VIP)來篩選和確定差異變量。VIP是PLS-DA的加權(quán)平方和，指示變量對整個模型的重要性。VIP為>1的變量被認(rèn)為是負(fù)責(zé)分離的變量，在本研究中被定義為區(qū)分代謝物。在單變量統(tǒng)計分析中，使用P值來評估不同變量的統(tǒng)計顯著性。我們結(jié)合這兩個標(biāo)準(zhǔn)篩選出VIP為>1，P值為<0.05的變量作為差異變量。觀察到銅綠微囊藻(53個下調(diào)和31個上調(diào))、來自微宇宙的水生微生物(39個下調(diào)和18個上調(diào)的代謝物發(fā)生了顯著的變化。)和培養(yǎng)基樣品(53個下調(diào)和10個上調(diào))。

6在共培養(yǎng)和單培養(yǎng)體系中銅綠微囊藻和水生微生態(tài)系統(tǒng)的代謝特征和途徑變化

與對照組相比，實驗組中銅綠微囊藻的(圖6B)戊糖磷酸代謝(PP)途徑和糖酵解中間產(chǎn)物，如葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)和核酮糖-5-磷酸(Ru5P)顯著增加。G6P和F6P通過與卡爾文循環(huán)的生化反應(yīng)相互聯(lián)系，以糖原生物合成來消耗能量。它們的積累對銅綠微囊藻的生長起到了積極的作用，說明共培養(yǎng)體系提高了銅綠微囊藻的固碳能力。實驗組中琥珀酸，三羧酸(TCA)循環(huán)的中間產(chǎn)物比對照組高18.30倍，PP途徑、糖酵解和TCA循環(huán)中這些增加的中間產(chǎn)物可以為氨基酸合成和其他細(xì)胞大分子的轉(zhuǎn)移提供前體。它們也有利于AKP和MC合成和細(xì)胞生長所需的還原酶(NADPH和NADH)和能量(ATP)的產(chǎn)生。銅綠微囊藻的AKP合成暗示了細(xì)胞對脅迫的反應(yīng)，特別是DOP的水解，以支持DIP含量較低條件下銅綠微囊藻的生長。較高的代謝水平會加速銅綠微囊藻的生長，這種有機(jī)體形成的聚集體在與微生物的競爭中占據(jù)主導(dǎo)地位，并產(chǎn)生各種有毒物質(zhì)，抑制其他微生物的生長。這一結(jié)論在圖1B和3D如圖所示，其表明了共培養(yǎng)體系中銅綠微囊藻的生長速度明顯快于單一培養(yǎng)體系，并產(chǎn)生了大量的MCs。總體而言，銅綠微囊藻中這些途徑的上調(diào)有利于MCs、AKP和能量的產(chǎn)生，從而提高銅綠微囊藻的競爭能力和防御能力。糖參與能量代謝，其作為信號分子或滲透保護(hù)劑發(fā)揮關(guān)鍵作用。在共培養(yǎng)過程中，處理組中可溶溶質(zhì)(如塔格糖、1，5-脫水葡萄糖醇、蔗糖或同種異體)的顯著增加降低了細(xì)胞內(nèi)的水勢以維持滲透壓從而避免脫水，比如在鹽脅迫期間。

與對照組相比，實驗組銅綠微囊藻中的幾種脂肪酸含量呈現(xiàn)下降的趨勢，如1-棕櫚酸單甘油酯(0.76倍)、硬脂酸(0.63倍)、棕櫚酸(0.60倍)和花生四烯酸(0.51倍)。脂肪酸和帶有磷脂的固醇是質(zhì)膜的主要成分。磷脂由極性頭基、甘油酯和兩條脂肪酰鏈組成。與磷脂極性頭基有關(guān)的甘油代謝在共培養(yǎng)條件下顯著增加(P≤0.05)。這些發(fā)現(xiàn)支持這樣的假設(shè)，即銅綠微囊藻通過調(diào)整其膜成分來維持膜的完整性，而銅綠微囊藻的細(xì)胞分裂的增加會改變細(xì)胞內(nèi)的代謝從而重建膜的完整性。

氨基酸作為滲透調(diào)節(jié)劑在藍(lán)藻的生理過程中起著重要的作用，是合成防御相關(guān)代謝物和信號分子的前體。因此對這些代謝作用的了解有助于對藍(lán)藻抵御壓力的整體理解。這些氨基酸包括羥胺(0.71倍)、去甲亮氨酸(0.83倍)、N-甲基-D、L-丙氨酸(0.71倍)和丙氨酸(0.72倍)，實驗組這些氨基酸的含量均低于對照組。我們推測對照組氨基酸(含N元素)的減少是由于蛋白質(zhì)合成加速以滿足銅綠微囊藻的生長所致。天冬氨酸是銅綠微囊藻合成微囊藻毒素的重要底物，可由微生物通過TCA循環(huán)中間體合成。因此實驗組中天冬氨酸的增加可能有助于微囊藻毒素的過量生產(chǎn)(圖3D)。

在微宇宙中，實驗組中幾個參與能量代謝途徑的中間產(chǎn)物，如糖酵解、TCA循環(huán)和糖代謝在共培養(yǎng)后減少(圖6C)。這些中間體的減少可以歸因于負(fù)面環(huán)境因素(pH、DO、MC和DIP)導(dǎo)致水生微生物防御能力的降低，這一發(fā)現(xiàn)也與共培養(yǎng)后水生微宇宙中Chl-a的減少是一致的。

7種間相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

在代謝組學(xué)水平上，實驗組中下列代謝物的含量增加較為明顯：D-甘油酸(1.78倍)、 甘油單油酸酯(1.63倍)和二甘油(1.63倍)。此外，共培養(yǎng)基中甘油單油酸酯、D-甘油酸、雙甘油和MCs的濃度高于單一培養(yǎng)基中的濃度(表3)，表明這些化合物是由銅綠微囊藻分泌的。甘油單油酸酯無毒且可生物降解，而雙甘油可作為碳源生物利用。為了驗證其潛在的化感作用，將MCs和D-甘油酸加入到單獨的單一培養(yǎng)微宇宙中。葉綠素a含量隨微宇宙中MCs的存在而降低，但與甘油酸保持不變(圖7)，表明MCs在微宇宙中總浮游植物的減少中起一定作用。我們無法證實MC是否能改變原來培養(yǎng)的微生物群落。然而微宇宙中MCs似乎對附近的一些生物有毒性，會導(dǎo)致浮游植物總量的減少。藍(lán)藻還會與MCs的結(jié)合保護(hù)蛋白免受氧化應(yīng)激，從而提高藍(lán)藻的生存能力MCs。在共培養(yǎng)條件下，銅綠微囊藻或水生微生物代謝的各種物質(zhì)(如葡萄糖-1-磷酸、丙二酸和肉堿)的表達(dá)除上調(diào)外，下調(diào)作用更為明顯。且與單一培養(yǎng)相比，這些物質(zhì)的下調(diào)也可能影響共培養(yǎng)水生微生物的生長。

圖8顯示了共培養(yǎng)后銅綠微囊藻和微生物群落的變化示意圖。我們的研究表明，銅綠微囊藻可以分泌AKP，使死亡和腐爛的微生物在磷源不足時產(chǎn)生DOP。同時，銅綠微囊藻產(chǎn)生多種有毒物質(zhì)，如MCs能夠抑制水生微生物在能量代謝途徑(如糖酵解、TCA循環(huán)、糖代謝等)中積累的一些關(guān)鍵中間產(chǎn)物，從而抑制微生物的生長。在銅綠微囊藻的生長過程中會產(chǎn)生MCs、AKP和能量以增強(qiáng)其競爭能力和防御能力。銅綠微囊藻略微降低了細(xì)菌群落的多樣性和豐度，但對真核生物的多樣性和豐度的影響更為顯著。此外，銅綠微囊藻或裂解會釋放的一些代謝產(chǎn)物可能對生物群有害，并對藻類競爭對手或捕食者的生長產(chǎn)生負(fù)面影響，這可能是使這一光合原核生物群體有機(jī)會在廣泛的生境中茁壯成長的關(guān)鍵因素。

原文網(wǎng)址：https://doi.org/10.1128/AEM.01362-19