科研 | Microb. Biotechnol.：適應(yīng)高環(huán)境溫度的大鼠腸道微生物組和代謝譜的變化（國人佳作）
編譯：微科盟紅燒大肥鷗，編輯：微科盟Tracy、江舜堯。
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導讀熱適應(yīng)（HA）是通過誘導積極的生理適應(yīng)來提高熱應(yīng)激耐受性的最佳策略。有證據(jù)表明，腸道微生物組在HA的發(fā)展中起著基礎(chǔ)性作用，調(diào)節(jié)腸道菌群可以提高對熱暴露的耐受性并降低中暑風險。在本研究中，我們首次應(yīng)用16S rRNA基因測序和非靶向液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）代謝組學研究了HA后大鼠腸道微生物組和糞便代謝譜的變化，HA受試者的腸道菌群表現(xiàn)出更高的多樣性和更豐富的微生物。HA改變了腸道菌群組成，主要益生菌乳桿菌屬（Lactobacillus）和振蕩桿菌屬（Oscillospira）的數(shù)量顯著增加，藍藻屬（Blautia）和小球藻屬（Allobaculum）數(shù)量顯著減少。HA后糞便代謝組也有明顯改變，在13種受擾代謝物中，（S）-AL 8810和雷公藤紅素均升高；此外，兩個增加的屬與兩個上調(diào)的代謝物正相關(guān)，而與其他11個下調(diào)的代謝物呈負相關(guān)，而兩個下降的屬與上調(diào)/下調(diào)代謝物之間的相關(guān)性則完全相反。綜上所述，HA處理28天后，腸道菌群落結(jié)構(gòu)和糞便代謝組的結(jié)構(gòu)均得到改善。這些發(fā)現(xiàn)為腸道菌群的改善及其作為HA提供抗熱應(yīng)激保護的潛在機制提供了新的見解。
原名：Alterations in the gut microbiome and metabolic profile in rats acclimated to high environmental temperature譯名：適應(yīng)高環(huán)境溫度的大鼠腸道微生物組和代謝譜的變化
期刊：Microbial biotechnology
通訊作者單位：軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所為了證實HA對健康有積極作用，本研究對HA和對照(CR)受試者進行了直腸溫度(TRE)的評估和比較。直腸溫度是測量核心體溫的金標準。與以前的研究結(jié)果一致，我們觀察到HA受試者的TRE曲線在熱暴露后的前兩周顯著增加，隨后穩(wěn)步緩慢下降，最終恢復到熱暴露前的水平。HA受試者的生長速度比CR受試者慢，HA實驗結(jié)束后，HA組體重顯著低于CR組(P<0.001，Wilcoxon sum檢驗)。為了評估HA期間腸道菌群的變化，本研究對熱暴露前1天(第0天)、熱暴露后第14天和第28天的腸道菌群進行了測序。從我們的16S rRNA測序(V3-V4區(qū))中共獲得4062872個讀數(shù)，經(jīng)質(zhì)量過濾后剩余3824443個讀數(shù)，相當于平均每個樣本79675個讀數(shù)(范圍從60593到82017)，所有樣本的測序深度足以描述每個相關(guān)的腸道微生物群落，總共確定了1387個可操作分類單元(OTU)，其最小數(shù)量占樣本總讀數(shù)的0.00005。正如我們預期的那樣，通過比較OTU的數(shù)量(1038和1071個OTU；P=0.6，Wilcoxon sum檢驗)和α多樣性(P>0.05，Wilcoxon sum檢驗)以及β多樣性，我們發(fā)現(xiàn)第0天CR和HA之間沒有顯著差異。28天時CR組和HA組的OTU數(shù)量有顯著性差異，而不是在第14天(分別為1313和1295個OTUS；P=0.19，Wilcoxon sum檢驗)。有趣的是，CR受試者的OTU數(shù)量在第一階段(從第0天到第14天)增加，然后在第二階段(從第14天到第28天)減少到接近第0天的數(shù)量；此外，CR大鼠OTU數(shù)目的所有差異均不顯著。我們推測CR受試者的腸道菌群可能是由于新的生活環(huán)境(第一階段)發(fā)生了變化，然后經(jīng)過一段時間的適應(yīng)(第二階段)恢復到初始狀態(tài)。我們通過測定微生物的α和β多樣性來比較不同組之間腸道微生物組的組成。通過ACE，Observed，Shannon和Simpson四個指數(shù)測得的Alpha多樣性顯示與第28天的CR受試者相比，HA受試者顯著增加（圖1A，所有P<0.05，Wilcoxon sum檢驗），且第14天的α多樣性指數(shù)無顯著差異。基于Bray-Curtis和Jaccard差異的主坐標分析（PCoA）顯示，HA受試者在第28天與CR受試者明顯分離（對于Bray和賈卡德距離）（圖1B，C）。此外，從第14天開始的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)顯著差異。 A.通過豐富度（ACE，實測）和多樣性（Shannon，Simpson）評估的Alpha多樣性。箱形圖通過Wilcoxon秩和檢驗顯示了HA和CR受試者之間的alpha差異顯著不同。Beta多樣性通過基于Bray–Curtis（B）和Jaccard（C）距離的主坐標分析（PCoA）進行評估。Anosim和多響應(yīng)置換程序（MRPP）測試顯示，HA組和CR組之間存在統(tǒng)計學上的顯著差異。P值：*P<0.05，**P<0.01。由于僅在第28天觀察到HA和CR受試者之間腸道微生物的群體差異，我們在隨后的分析中只考慮第28天的受試者。為了探索與HA相關(guān)的類群，我們在門和屬水平上對這兩組進行了差異豐度分析。在門的水平上，所有樣品中的優(yōu)勢細菌是Firmicutes，其次是擬桿菌、變形桿菌、藍藻和放線菌（圖2A）。在門的水平上，HA和CR受試者之間細菌群落組成存在細微但不顯著的差異（所有P>0.05，Wilcoxon sum檢驗）。屬水平分析表明，乳酸桿菌屬（一種主要的益生菌）和Oscillospira顯著增加，而Blautia屬和Allobaculum屬顯著減少，不同組的屬豐度分布有很大差異（圖2C）。A.門水平的相對豐度；B.基于聚類分析的熱圖顯示了在第28天HA和CR之間的前40個不同代表性分類單元的相對豐度。使用DESeq2進行了豐度差異分析。分類群的分類包括門和科。C.熱圖樹顯示的HA與CR中的屬顯著不同，以及它們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。豐度剖面用z分數(shù)表示。接下來，我們使用DESeq2進行了差異豐度分析，該方法使用負二項式GLM獲得兩個條件之間的最大似然估計，這樣我們就可以更準確地探索導致HA和CR組之間腸道微生物組成差異的細菌類群?；谇?/span>40個不同類群的系統(tǒng)聚類分析熱圖來總結(jié)HA和CR組的樣本間變化，我們發(fā)現(xiàn)腸道微生物區(qū)系與HA和CR受試者有明顯的分離（圖2B）。LEfSe分析進一步證實了差異豐富的分類群。結(jié)果如圖3所示，HA組和CR組之間有20個分類單元，包括8個屬并且差異顯著。與上述結(jié)果一致，乳酸桿菌屬在HA受試者中富集。圖3 通過LEfSe分析顯示與HA相關(guān)的生物標志物分類群
綠色表示HA組中富集的類群，而紅色表示CR組中富集的類群。4.HA擁有改良的微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)為了檢查HA微生物群落結(jié)構(gòu)的變化以及HA對微生物相互作用的影響，我們利用稀疏反演協(xié)方差估計進行了生態(tài)學關(guān)聯(lián)（SPIEC-EASI）來推斷HA和CR中的兩個微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。通常，在兩個生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)大于負相關(guān)（圖4A，B）。同一屬的兩個OTU之間呈正相關(guān)，而不同屬的兩個OTU之間既有正相關(guān)也有負相關(guān)。兩個網(wǎng)絡(luò)之間的頂點度分布相似（圖4C）。我們首先比較了藍藻屬、振蕩螺旋菌屬、乳桿菌屬和球狀芽孢桿菌屬這四個有顯著差異的屬的OTUS程度。HA網(wǎng)絡(luò)中乳酸桿菌的含量顯著低于CR網(wǎng)絡(luò)（P=0.0396，Wilcoxon sum檢驗），而其他三個屬的OUT含量在兩個網(wǎng)絡(luò)中相似。然后，我們通過依次移除中心點（具有高度集中性的節(jié)點）來比較這些網(wǎng)絡(luò)對攻擊的魯棒性。結(jié)果表明，通過刪除高級節(jié)點，HA網(wǎng)絡(luò)比CR網(wǎng)絡(luò)具有更強的魯棒性（圖4D）。圖4 在HA（A）和CR（B）組中使用SPIEC-EASI推斷生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點代表OTU，并根據(jù)門類著色；紅色邊緣表示正相關(guān)，綠色邊緣表示負相關(guān)。C.兩個網(wǎng)絡(luò)的度分布相似。D.使用自然連通性來衡量網(wǎng)絡(luò)的健壯性，通過順序移除高度節(jié)點來衡量網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)健性。結(jié)果表明，HA網(wǎng)絡(luò)比CR網(wǎng)絡(luò)具有更強的穩(wěn)健性。
由于16S rRNA測序結(jié)果顯示HA處理28天后腸道微生物群落發(fā)生了顯著變化，我們進一步使用非靶向LC-MS在正離子（ES+）和負離子（ES-）模式下檢測了HA處理28天后糞便代謝組是否受到干擾。在ES+和ES-模式下我們分別鑒定出2588個和1715個特征代謝物，偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖顯示HA和CR組之間有明顯的分離（圖5A，B）。我們采用10次交叉驗證的方法評價了這兩個PLS-DA成分的質(zhì)量，并且在ES+和ES-模式下它們的R2分別為0.901（0.935）和0.403(0.349)?？傮w而言，HA后糞便代謝組發(fā)生了明顯變化。為了確定與HA相關(guān)的差異代謝物，我們計算了HA與CR中所有代謝特征的倍數(shù)變化（FCs）、P值和PLS-DA預測變量重要性（VIP）得分，總體而言，在ESI+和ESI-模式中，分別發(fā)現(xiàn)了9個和34個顯著的代謝特征（FC≥2或≤0.5，P≤0.05和VIP>2）。正如我們預期的那樣，使用基于差異代謝物的層次聚類，HA和CR受試者的糞便代謝組中有明顯的分離（圖5C）。圖5 糞便代謝組在ES+（A）和ES-模式（B）中的PLS-DA評分圖。C.熱圖顯示糞便代謝產(chǎn)物HA與CR相比有顯著差異。D.擾亂的腸道細菌家族和改變的糞便代謝物之間的相關(guān)性。糞便細菌及其代謝物相關(guān)性的Spearman等級相關(guān)系數(shù)和P值
為了在途徑水平上進一步了解這些代謝變化，我們使用MetaboAnalystR進行了途徑富集分析。HA后共有9種代謝途徑發(fā)生了明顯變化，包括甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝，賴氨酸降解，酪氨酸代謝，氨?；?/span>tRNA生物合成，類固醇激素生物合成，煙酸和煙酰胺代謝，甘油脂代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝。最后，在我們的路徑富集分析中假定注釋的特征與單變量統(tǒng)計分析中發(fā)現(xiàn)的重要代謝特征之間存在重疊，從而存在13種重要的差異代謝物。在這13種代謝物中，有兩種代謝物在HA患者中表達上調(diào)，包括(S)-AL 8810和雷公藤紅素。此外，還有11種代謝物表達下調(diào)，包括己巴比妥、胞嘧啶、L-天冬氨酸、腺嘌呤、惡唑烷酮、D-乳酸、亮氨酰亮氨酸、甲硫基亮氨酸、丙酰甘氨酸和乙酰丙酸乙酯。雷公藤紅素已被證明能夠誘導熱休克因子1（HSF1）介導的HSP基因，如HSP30和HSP70，它們在抵抗熱應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。靶向代謝組學被用來驗證雷公藤紅素的表達，結(jié)果證實了HA術(shù)后雷公藤紅素水平的升高（圖3）。6.不同腸道微生物與代謝物的相關(guān)性研究由于HA后腸道菌群和代謝產(chǎn)物均受到干擾，我們利用Spearman相關(guān)系數(shù)分析了這4個受干擾屬與13種糞便代謝產(chǎn)物之間的功能相關(guān)性。如圖5D所示，乳桿菌屬和振蕩螺旋菌屬的增加與兩種上調(diào)的代謝物(S)-AL8810和雷公藤紅素呈正相關(guān)，與其他11種下調(diào)的代謝物呈負相關(guān)，而這兩個減少的屬則表現(xiàn)出相反的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)表明腸道菌群有助于糞便代謝組的變化。熱適應(yīng)導致生理適應(yīng)，可以改善熱耐受性和性能，并減少生理勞損和炎熱條件下患熱病的風險。先前的研究表明，熱應(yīng)激和中暑會增加腸道的通透性并破壞細菌屏障，從而導致動物腸道微生物群落發(fā)生重大擾動。此外，益生菌，例如枯草芽孢桿菌，可以保護人或動物免受熱應(yīng)激的影響，通過增強腸道完整性和改善腸道微生物組，使它們更快地恢復到完全健康?；谶@些研究，我們推斷腸道菌群在對HA的反應(yīng)中起重要作用。我們的研究旨在使用16S rRNA基因測序和LC-MS研究HA對腸道微生物組和代謝組的影響。為了建立HA模型，我們將大鼠在35±1°C和60±5%濕度的房間中，每天放置120分鐘，共28天，觀察HA對核心體溫和體重的影響。HA后核心體溫顯著降低，這與之前的研究結(jié)果一致。我們通過比較HA和CR受試者的微生物群落來確定HA是否影響大鼠的糞便微生物區(qū)系。微生物群多樣性分析表明，僅能在治療后第28天觀察到HA和CR受試者之間腸道微生物區(qū)系的種群差異，而不是在治療后第0天或第14天觀察到群體差異；與CR組相比，HA組在第28天表現(xiàn)出更高的多樣性和更豐富的微生物。有人提出，豐富多樣的微生物菌群更穩(wěn)定、更健康，這些發(fā)現(xiàn)表明在熱暴露28天后可以在大鼠中建立明顯的HA。為了更準確地探索有助于不同組之間腸道微生物群組成分化的細菌類群，我們在門類和屬水平上進行了差異分析。與先前的研究一致，在門類水平上Firmicutes、擬桿菌、變形桿菌、藍細菌和放線菌是五個主要的門；但是，細菌群落組成存在細微但不顯著的差異。我們的屬水平分析表明，乳酸桿菌和HA受試者的耳蝸螺旋體明顯增加。據(jù)報道，乳酸菌在介導對微生物病原體的先天和適應(yīng)性免疫防御以及防止成年動物的結(jié)腸上皮屏障失效方面具有重要作用。LEfSe分析進一步證實了細菌分類群具有明顯不同的豐度，之后益生菌（如乳酸菌）會減弱熱應(yīng)激誘導的腸道通透性，并提供針對熱應(yīng)激的細胞保護作用。Oscillospira水平與人類健康呈正相關(guān)，而降低Oscillospira可能導致涉及炎癥的疾病。為了研究HA如何影響腸道菌群中的微生物相互作用，我們使用SPEIC-EASI算法推斷了兩個生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。在兩個網(wǎng)絡(luò)中共現(xiàn)相關(guān)比共排除相關(guān)更多。與先前的研究一致，同一屬的OTU之間的相關(guān)性趨于正相關(guān)，而不同屬的OTU之間則既有正相關(guān)也有負相關(guān)。此外與CR網(wǎng)絡(luò)相比，我們證明了HA網(wǎng)絡(luò)通過順序移除高級別節(jié)點顯示出了對模擬攻擊的更高穩(wěn)健性。接下來，我們采用基于LC-MS的非靶向代謝組學方法揭示了28天HA對糞便代謝組的影響。通過差異性分析，發(fā)現(xiàn)總共有43種代謝物因HA而改變。途徑富集分析表明，HA后參與賴氨酸降解、氨基酰tRNA生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝的代謝物發(fā)生了顯著變化。最后，我們將推測的代謝物在富集途徑中與差異分析發(fā)現(xiàn)的顯著代謝特征重疊，得到13個顯著的差異代謝物，其中(S)-AL 8810和雷公藤紅素顯著增加。先前的研究表明，雷公藤紅素是一種從雷公藤根中提取的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗癌活性，是熱休克反應(yīng)的藥理活性調(diào)節(jié)因子。因此，我們推測雷公藤紅素在高溫環(huán)境下對HA的保護作用有重要貢獻。最后我們進行了Spearman的相關(guān)性分析，以探索顯著變化的屬與代謝物之間的關(guān)系。結(jié)果表明，兩個增加的屬與2個上調(diào)的代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)，而與11個下調(diào)的代謝產(chǎn)物呈負相關(guān)，而兩個下降的屬與上調(diào)/下調(diào)代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性則完全相反。這些發(fā)現(xiàn)表明，HA誘導的腸道菌群修飾與糞便代謝產(chǎn)物相關(guān)。這項研究也有局限性。為了表征HA期間腸道菌群的變化，我們收集糞便樣品并在熱暴露后的第0、14和28天進行測序。HA是一個長期的慢性過程。通過比較和縱向分析，我們需要探索其他時間點的腸道微生物群，以獲得更可靠和更精確的結(jié)果。雖然16S rRNA基因測序技術(shù)對微生物組研究非常有用，但它物種水平分辨率較低，并且對某些屬的判別能力較弱。理想情況下，全基因組鳥槍測序可以提供更高的菌株水平分辨率和與微生物群落組成和功能有關(guān)的更準確的信息。此外，盡管我們發(fā)現(xiàn)了差異性腸道菌群與差異性代謝物之間存在顯著的相關(guān)性，但在未來的研究中還需要做更多的工作來探索這些相關(guān)性的機制。最后，這項研究的結(jié)果是相關(guān)的，并不支持腸道菌群與HA之間的因果關(guān)系，這表明缺乏足夠的證據(jù)來區(qū)分腸道菌群是HA的原因還是后果，未來需要利用糞便微生物區(qū)系移植（FMT）等策略進行研究，以闡明潛在的因果關(guān)系。然而我們的研究首次證明HA對腸道菌群群和糞便代謝組有顯著影響，這可能是HA提供抗熱應(yīng)激保護的一個潛在機制。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33620148/
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