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編譯：嗯，編輯：十九、江舜堯。

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1 環(huán)狀RNA的屬性與特征

環(huán)狀RNA由前體mRNA通過經(jīng)典可變剪切加工產(chǎn)生，是一類由3'端反向與5'端連接形成的共價閉合環(huán)狀RNA分子。根據(jù)環(huán)狀RNA包含的序列類型，可以將環(huán)狀RNA分為3類：外顯子環(huán)狀RNA (EcRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA (CiRNA)和外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA(EIcRNA)。已有文獻(xiàn)報道，一些內(nèi)含子環(huán)狀RNA被隔離在細(xì)胞核中，而外顯子環(huán)狀RNA則被輸出到細(xì)胞質(zhì)中。目前發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA以外顯子環(huán)狀RNA為主，可廣泛存在于胞漿中。

環(huán)狀RNA的結(jié)構(gòu)缺少5’-帽結(jié)構(gòu)和3’末端結(jié)構(gòu)，這使得它們對核糖核酸酶(如RNase R)的消化產(chǎn)生了抗性，并具有比線性RNA長10倍的半衰期。大部分環(huán)狀RNA序列高度保守。最近的研究表明，大約15000個人類環(huán)狀RNA序列可以在小鼠或大鼠基因組中檢測到。環(huán)狀RNA通常在絕大多數(shù)人體組織中表達(dá)，尤其在人腦中高表達(dá)。此外，環(huán)狀RNA的表達(dá)總是以組織或細(xì)胞特異性的方式進(jìn)行，這使得它們成為人類癌癥生物標(biāo)志物研究的合適候選基因。

2 環(huán)狀RNA的全基因組分析

通過對總RNA中的核糖體RNA(rRNA)清除后建庫并分析挖掘新的環(huán)狀RNA，利用該方法可以同時提供編碼RNA和非編碼RNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)信息。此外，對環(huán)狀RNA的定量分析需要相當(dāng)大的測序深度，以確?？梢哉_識別環(huán)狀RNA。Salzman等人使用核糖體RNA缺失的轉(zhuǎn)錄組測序法鑒定了人類腫瘤細(xì)胞中存在的scrambled-exon以及潛在環(huán)狀RNA。在最近的一項研究中，Memczak等人系統(tǒng)地探索了環(huán)狀RNA在人類、小鼠和線蟲中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的表達(dá)有高度組織特異性，同時，環(huán)狀RNA在同一生物的不同發(fā)育階段也具有高度表達(dá)特異性。隨后，在測序前研究者們采用全基因組RNA外切酶富集策略，這種方法可以對樣品中環(huán)狀RNA分子進(jìn)行富集，從而可以鑒定出更多的環(huán)狀RNA。最近的一項研究使用外顯子組捕獲測序?qū)Γ?/span>2000個癌癥樣本中的環(huán)狀RNA進(jìn)行了檢測和定量分析，并獲得了大量富集的環(huán)狀RNA。

不斷發(fā)展的生物信息學(xué)為識別新的環(huán)狀RNA提供了新方法，這些方法主要是對基于反向剪接原則對基因序列進(jìn)行跨域讀?。?/span>backsplice junction-spanningsequencing reads），首先，那些連續(xù)排列的基因組和/或轉(zhuǎn)錄組的序列被算法過濾篩除，從而使unaligned reads以反向剪接（backsplice）的方式進(jìn)行連接，但這種算法可能會引起排序與匹配錯誤，并導(dǎo)致數(shù)據(jù)的“假陽性”。開發(fā)這些算法是為了避免reads counts，樣本數(shù)，抗-RNase R（RNase R resistance）的干擾導(dǎo)致的數(shù)據(jù)“假陽性”。但如果研究者采用多種環(huán)狀RNA生物信息學(xué)預(yù)測算法進(jìn)行組合分析，則可很大程度上減少“誤報”。

3 環(huán)狀RNA的功能

以帽子不依賴方式翻譯蛋白：環(huán)狀RNA可分為三種不同類型:外顯子環(huán)狀RNA (EcRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA (CiRNA和外顯子-內(nèi)含子環(huán)狀RNA (EIcRNA)。CiRNA和EIcRNAs可能被隔離在細(xì)胞核中，而EcRNAs則主要輸出到細(xì)胞質(zhì)中。既往研究認(rèn)為，5′與3′非翻譯區(qū)（UTR）是真核生物細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯必要條件，由于缺乏5’-帽結(jié)構(gòu)與3’-末端，環(huán)狀RNA一度被認(rèn)為是非編碼RNA，但近年研究表明，在真核細(xì)胞中，IRES-和m6a介導(dǎo)的翻譯起始都是環(huán)狀RNA翻譯的重要機(jī)制。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點（IRES）與N6-甲基腺苷（m6A）促進(jìn)了人細(xì)胞中環(huán)狀RNA的蛋白翻譯的有效啟動，被認(rèn)為是環(huán)狀RNA翻譯的潛在啟動機(jī)制。目前還不知道真核生物中是否有其他翻譯機(jī)制。

大量研究證明環(huán)狀RNA可與多核糖體結(jié)合，其中包括蛋白翻譯的起始密碼子AUG以及開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF),這意味著環(huán)狀RNA或許有蛋白質(zhì)翻譯功能。在一項研究中， Sarnow等人發(fā)現(xiàn)，人工構(gòu)建的環(huán)狀RNA可招募40s核糖體亞基，并在體外啟動可檢測肽的翻譯。然而，本實驗并不支持環(huán)狀RNA在體內(nèi)也可以作為翻譯分子的觀點。2015年，Abe等人證明了內(nèi)源性環(huán)狀RNA作為翻譯模板。含有無限開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)的環(huán)狀RNA可以通過滾動循環(huán)進(jìn)行高效翻譯，從而產(chǎn)生大型蛋白聚合體。2017年, Legnini 等人報道了Circ-ZNF609，這是由ZNF609外顯子反剪接形成的環(huán)狀RNA，它能以剪接依賴和帽子不依賴的方式翻譯蛋白。

到目前為止，只有少部分的環(huán)狀RNA的生物學(xué)意義得到了研究，大部分環(huán)狀RNA被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)中的miRNA海綿。最具代表性的環(huán)狀RNA是ciRS-7，它包含了70多個miR-7保守結(jié)合位點。此外，circHIPK3還可以調(diào)節(jié)多種miRNA的轉(zhuǎn)錄活性。環(huán)狀RNA的另一個重要功能是充當(dāng)?shù)鞍缀＞d，部分環(huán)狀RNA可與特異性蛋白結(jié)合并成為蛋白的“存儲庫”，誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞對細(xì)胞外刺激的快速反應(yīng)。

1）環(huán)狀RNA以帽子不依賴方式翻譯蛋白（圖1）：IRES-和m6a介導(dǎo)的翻譯起始都是circRNA翻譯的重要機(jī)制。真核細(xì)胞中環(huán)狀RNA的蛋白翻譯不依賴帽子結(jié)構(gòu)。

2）IRESs介導(dǎo)的翻譯：IRESs是位于mRNA 5’端的非編碼區(qū)序列，可以直接招募核糖體啟動翻譯。大約10%的人類mRNA分子中包含IRES序列。IRES介導(dǎo)的翻譯方式是目前被廣泛接受的環(huán)狀RNA翻譯啟動機(jī)制之一。人工構(gòu)建的體外合成環(huán)狀RNA可以被成功翻譯, 人工構(gòu)建的IRES和GFP序列片段可以通過精確的反向剪接連接在一起。 IRES介導(dǎo)的翻譯可以使環(huán)狀RNA生成功能性熒光蛋白（GFP）。但到目前為止，環(huán)狀RNA中IERS數(shù)目仍然未知。最近研究表明，大量的AU-rich 基序列(~ 10 nt)可以具有類IRES功能并啟動環(huán)狀RNA翻譯。任何長度大于50 nt環(huán)狀RNA，則可能包含具IRES類似結(jié)構(gòu)的六聚體片段。IRESs對環(huán)狀RNA的要求很容易得到滿足，這說明了細(xì)胞質(zhì)中環(huán)狀RNA以帽子不依賴方式進(jìn)行蛋白翻譯的重要性和普遍性。

   3）m6A（N6-methyladenosines）修飾后的翻譯：環(huán)狀RNA可以進(jìn)行m6A甲基化修飾，m6A修飾是RNA中存在的一種堿基化學(xué)修飾方式，參與調(diào)控了RNA許多重要功能。m6A全稱是N6-methyladenosine，是在RNA分子5’端的A堿基第六位的N元素上加上一個甲基基團(tuán)的修飾方式。已有研究表明，5’端的非編碼區(qū)（UTR）中的m6A可以直接與真核起始因3 (eIF3)結(jié)合，并繞過m7G cap的需求直接募集43S預(yù)啟動復(fù)合物（43S preinitiationcomplex），以帽子不依賴方式進(jìn)行蛋白翻譯。最近一項研究表明，RNA中5’非編碼區(qū)存在m6A殘基，控制核糖體掃描以及后續(xù)啟動密碼子在綜合應(yīng)激反應(yīng)中的啟動。mRNA ATF4的翻譯啟動由eIF2α信號通路以及m6A修飾后對氨基酸饑餓（amino acidstarvation）產(chǎn)生反應(yīng)，同時，干擾m6A去甲基化酶和甲基轉(zhuǎn)移酶可以影響ATF4的翻譯。因此，5’非編碼區(qū)中m6A修飾在替代翻譯啟動過程中起著動態(tài)調(diào)節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，其他轉(zhuǎn)錄本中5’非編碼區(qū)的m6A甲基化修飾還可以控制起始密碼子的選擇，從而進(jìn)行替代翻譯的控制。有報道稱，一些含m6A的短RNA元件具有類似于IRES的活性來啟動環(huán)狀RNA翻譯。Yang等人的研究表明，短mRNA元件小紅含有的大量的m6A元件具有IRES活性，并可以啟動環(huán)狀RNA的翻譯。單個的m6A修飾足以啟動環(huán)狀RNA翻譯，通過m6A的識別蛋白YTHDF3與環(huán)狀RNA的修飾位點結(jié)合，募集eIF4G2啟動翻譯。當(dāng)m6A去甲基化酶FTO被消耗，則可以抑制環(huán)狀RNA翻譯時。同時，敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14可促進(jìn)應(yīng)激條件下環(huán)狀RNA的翻譯。使用RNase R進(jìn)行預(yù)處理，并用高通量測序檢測m6A-seq，研究者發(fā)現(xiàn)至少13%的環(huán)狀RNA包含m6A修飾,研究者證明了250個環(huán)狀RNA與多聚體相關(guān)，它們可能具有積極的翻譯潛力。

4 用于識別環(huán)狀RNA編碼潛能的生物信息學(xué)工具

利用生物信息學(xué)方法對具有編碼潛力的環(huán)狀RNA進(jìn)行系統(tǒng)識別是必要的，并可為環(huán)狀rna衍生蛋白的功能研究提供思路。本文綜述了預(yù)測環(huán)狀RNA編碼潛能的生物信息學(xué)工具(Table1).

表一

5 環(huán)狀RNA翻譯評價的實驗方法

除了利用計算進(jìn)行估計，研究者更希望可以通過實驗驗證環(huán)狀RNA是否確實具有翻譯能力，核糖體圖譜分析（ Ribosome profiling）與多聚核糖體分餾法（polysomal fractionation）使整體分析成為可能。從這些線索可以推斷核糖體的密碼子運動。近年來，人們利用核糖體譜對全基因組翻譯進(jìn)行了鑒定。通過核糖體足跡中存在的反向剪接連接進(jìn)行鑒定，39個基因共產(chǎn)生40個與核糖體結(jié)合的環(huán)狀RNA。通過蔗糖密度梯度離心技術(shù)，多聚核糖體分餾法可以直接測定環(huán)狀RNA在全基因組范圍內(nèi)的翻譯效率。這兩種方法是互補的，使全基因組的翻譯分析成為可能。對于環(huán)狀RNA編碼的潛在多肽，質(zhì)譜分析是一種廣泛應(yīng)用的多肽檢測平臺。

6 環(huán)狀RNA在人類腫瘤中的翻譯

 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種翻譯的環(huán)狀RNA，它們在人類癌癥中起著關(guān)鍵作用。環(huán)狀RNA編碼的多肽通過干擾腫瘤代謝或轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑瘤作用，本研究對其進(jìn)行詳細(xì)介紹。已有文獻(xiàn)報道，一些環(huán)狀RNA通過編碼多肽可基于RNA的調(diào)控機(jī)制發(fā)揮其生物學(xué)功能。部分研究表明，有些環(huán)狀RNA在人類癌癥中具有雙向功能，這代表環(huán)狀RNA的能力仍有待進(jìn)一步探索（Table 2）。

因此，環(huán)狀RNA編碼的多肽具有成為治療靶點和腫瘤生物標(biāo)志物的巨大潛力。鑒于其高度腫瘤特異性，環(huán)狀RNA編碼的多肽將成為抗腫瘤蛋白藥物篩選的新靶點。迄今為止，腫瘤生物標(biāo)志物在早期發(fā)現(xiàn)、精確治療和預(yù)測預(yù)后方面發(fā)揮著重要作用。這些環(huán)狀RNA編碼的多肽有很大的潛力成為有用的腫瘤生物標(biāo)志物。綜上所述，環(huán)狀RNA編碼蛋白的研究將為腫瘤的診斷和治療提供新的途徑。

（1）circLINC-PINT在腦膠質(zhì)瘤中的翻譯

circLINC-PINT來自于LINC-PINT（long intergenic non-coding RNA p53-induced transcript），并編碼含有87個氨基酸的肽(PINT87aa)。這個1084 nt環(huán)狀rna是由外顯子2的循環(huán)形成的。PINT87aa主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，對細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生具有抑制作用。PINT87aa可與PAF1復(fù)合物相互作用，抑制多種致癌基因的轉(zhuǎn)錄延伸，同時，PINT87aa作為PAF1復(fù)合物的結(jié)合伙伴，對PAF1復(fù)合物的正確定位起著重要的作用。

（2）circβ-catenin在肝細(xì)胞癌中的翻譯

Wnt /β-catenin信號通路在肝細(xì)胞癌中進(jìn)行了廣泛的研究。GSK3β誘導(dǎo)的β-catenin磷酸化和降解可能導(dǎo)致Wnt通路的激活，這與肝細(xì)胞癌發(fā)生以及預(yù)后不良密切相關(guān)。circβ-catenin是CTNNB1基因外顯子2 至外顯子7通過反向剪接形成的1129nt 環(huán)狀RNA分子。由CTNNB1基因可以形成24個環(huán)狀RNA。circβ-catenin是在肝癌細(xì)胞中唯一的亞型表達(dá)，circβ-catenin可以編碼β-catenin-370aa,其主要位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步的體外和體內(nèi)實驗表

明circβ-catenin可以通過激活Wnt通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長。同時，研究者證明，由GSK3β充當(dāng)“誘餌”,β-catenin-370aa可以使GSK3β誘導(dǎo)的β-catenin 降解失效。

（3）circFBXW7在膠質(zhì)瘤和乳腺癌中的翻譯

circRNA是由腫瘤抑制因子E3連接酶FBXW7產(chǎn)生的，名為circFBXW7。circFBXW7通過FBXW7基因的外顯子3至外顯子4反剪接形成，其長度為620 nt。circFBXW7編碼翻譯FBXW7-185aa，FBXW7-185aa被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的腫瘤抑制因子。它與去泛素化酶USP28競爭性相互作用，拮抗USP28誘導(dǎo)的c-Myc的穩(wěn)定性。

（4）circPPP1R12A在結(jié)腸癌中的翻譯

鄭等人發(fā)現(xiàn)了一種新的circRNA，名為circPPP1R12A，由PPP1R12A基因產(chǎn)生。circPPP1R12A編碼73個氨基酸(circPPP1R12A-73aa)。與circSHPRH結(jié)構(gòu)類似，在蛋白質(zhì)翻譯過程中，環(huán)狀結(jié)構(gòu)包含重疊的起始密碼子和終止密碼子。circPPP1R12A在腫瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，且在結(jié)腸癌中表現(xiàn)出抑癌活性。功能分析表明，CircPPP1R12A-73aa可通過激活結(jié)腸癌Hippo-YAP信號通路，促進(jìn)結(jié)腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移能力。

（5）circAKT3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的翻譯

最近，Xia等人對一種由AKT3基因產(chǎn)生的環(huán)狀RNA(circAKT3)進(jìn)行了鑒定。circAKT3由AKT3基因的第3外顯子至第7外顯子產(chǎn)生，全長524 nt，編碼174個氨基酸新蛋白(AKT3-174aa)。對circAKT3表達(dá)的分析表明，AKT3-17aa具有潛在的抑癌活性。AKT3-174aa可與磷酸化的PDK1相互作用，限制AKT3-thr308磷酸化，并對PI3K/AKT信號強(qiáng)度起負(fù)調(diào)控作用。

（6）SHPRH-146aa在膠質(zhì)瘤與肝細(xì)胞癌中的作用

由SHPRH基因（SNF2 histone linker PHD RING helicase (SHPRH)）產(chǎn)生的新的環(huán)狀RNA被鑒定出來。成熟的環(huán)狀SHPRH是由26 ~ 29個外顯子反剪接形成的，環(huán)狀SHPRH的總長度為400個核苷酸。其中，基序UGAUGA包含重疊的起始密碼子和終止密碼子(起始密碼子為AUG，終止密碼子為UGA)。circSHPRH是真核細(xì)胞中第一個在蛋白翻譯過程中具有重疊起始和終止密碼子的環(huán)狀RNA。他編碼了一種新型蛋白(SHPRH-146aa)，這個蛋白由146個氨基酸組成，并在腫瘤進(jìn)程中表現(xiàn)出抑癌活性。進(jìn)一步研究表明，SHPRH- 146aa可以保護(hù)SHPRH蛋白不被泛素蛋白酶體降解。有研究稱circSHPRH可以編碼SHPRH-146aa并抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生，也可以作為miRNA海綿吸附者抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)程，同時，circSHPRH被認(rèn)為是肝癌的一種生物標(biāo)志物。因此，我們有理由推測circSHPRH有可能在其他人類腫瘤中也被翻譯出來。

（7）circZNF609在乳腺癌與肌肉生成過程中的作用

circZNF609可作為加速乳腺癌進(jìn)程的miRNA海綿，并可在肌肉生成過程中編碼蛋白。

關(guān)于環(huán)狀rna的翻譯及其在人類癌癥中的功能作用，研究者對此已經(jīng)有了新的認(rèn)識。在這篇綜述中，我們總結(jié)了環(huán)狀RNA可能作為翻譯模板的情況。研究者針對環(huán)狀RNA的研究，開辟了一個新的研究視角。毫無疑問，在不久的將來會有越來越多新的環(huán)狀RNA編碼蛋白被發(fā)現(xiàn)，一個隱藏的人類蛋白質(zhì)組將啟示我們環(huán)狀RNA在人類生活中的重要性。

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