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編譯：KT!，編輯：十九、江舜堯。

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1.數(shù)據(jù)收集

研究根據(jù)檢索號(hào)（accession number）SRP217534從NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫中下載RNA序列數(shù)據(jù)；從心臟的房室溝處獲取心外膜活檢樣本。

2.基因表達(dá)分析

    將下載的原始數(shù)據(jù)首先轉(zhuǎn)換為fastq格式，然后通過基因序列比對(duì)軟件hisat2與UCSC的hg19版本校對(duì)。基于FPKM的基因表達(dá)水平通過stringtie和R包軟件定量分析。根據(jù)GENCODE v19的注解，非編碼RNA的生物型中3prime_overlapping_ncrna, antisense, lincRNA, processed_transcript, sense_intronic, 和sense_overlapping被視作長鏈非編碼RNA。差異性表達(dá)分析采用t-檢驗(yàn)和差異倍數(shù)的方法，P值以0.05為顯著性的判斷界限，差異倍數(shù)以2為界限值。

3.功能富集分析

    功能富集分析包括基因富集的KEGG通路、GO富集，疾病富集采用超幾何分布檢驗(yàn)，也稱為普通富集分析（ORA）。

4.房顫中失調(diào)的IncRNA的功能推測(cè)

    對(duì)于這些IncRNA的功能學(xué)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析和基因集富集分析（GSEA）。首先對(duì)IncRNA和蛋白編碼基因（PCGs）進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，接下來，GSEA對(duì)已知IncRNA通路中高度相關(guān)的基因進(jìn)行富集豐度值的檢測(cè)。

5.IncRNA和蛋白關(guān)聯(lián)性預(yù)測(cè)

    采用深度學(xué)習(xí)法對(duì)LncRNA和相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)（LncADeep），它們?cè)谏舷掠位蚺帕猩系墓铂F(xiàn)性也都考慮在內(nèi)，最后與蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的LncRNA基因也參與差異表達(dá)基因(DEGs)富集的通路中。

6.數(shù)據(jù)分析

    兩樣本比較采用t檢驗(yàn)或者秩和檢驗(yàn)。層次聚類分析和主成分分析由R v3.6.0.完成。P<0.05視為具有顯著性差異。

1.利用長鏈非編碼RNA（LncRNA）和蛋白編碼基因（PCGs）之間的不同表現(xiàn)以區(qū)分房顫（AF）和竇性心律（SR）

利用RNA序列數(shù)據(jù)量化6個(gè)房顫和6個(gè)竇性心律研究對(duì)象的心外膜脂肪組織的表達(dá)情況，以此來描述房顫中的轉(zhuǎn)錄組變化特征。在這些樣本中總共鑒定了12656個(gè)PCGs和2213個(gè)LncRNA，鑒定結(jié)果以至少3個(gè)樣本中超過1個(gè)FPKM為界限。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)PCGs和LncRNA都可以區(qū)分房顫和竇性心律(Figure 1A-B)。LncRNA的誤診例數(shù)只有1例，即錯(cuò)誤地將房顫樣本誤認(rèn)為竇性心律樣本。而PCGs的誤診例數(shù)為 2例，因此前者的鑒別方式優(yōu)于后者。此外，對(duì)這些樣本進(jìn)行的差異表達(dá)基因的分析，共鑒定出376個(gè)失調(diào)的PCGs和95個(gè)LncRNA,仍然發(fā)現(xiàn)這兩者都可以將AF和SR樣本準(zhǔn)確區(qū)分(Figure 1C-D)。這些結(jié)果表明，LncRNA可能在AF病理機(jī)制中存在一定作用，同時(shí)也說明，PCGs在區(qū)分AF和SR中的不同性表現(xiàn)。

2.差異表達(dá)基因（DEGs）的功能富集分析

    為了在轉(zhuǎn)錄組水平揭示房顫的功能學(xué)改變，研究者進(jìn)行了差異表達(dá)基因的KEGG通路集、GO集和疾病分類數(shù)據(jù)集的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些KEGG通路比如TGF-β信號(hào)通路、ECM受體交互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路以及類固醇生物合成這些通路在上調(diào)的基因中高度富集。而在下調(diào)的基因中主要富集了hippo信號(hào)通路，金黃色葡萄球菌感染和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)途徑（Figure 2A）。TGF-β信號(hào)通路和ECM受體交互作用可能和心外膜脂肪組織的炎癥因子分泌有關(guān)。GO富集性分析發(fā)現(xiàn)骨骼肌系統(tǒng)和腎臟發(fā)育相關(guān)事件在差異表達(dá)的基因中顯著富集（Figure 2B），說明這些發(fā)育型疾病的基因與房顫發(fā)病機(jī)制可能緊密相關(guān)。疾病分類分析（DO）也同樣發(fā)現(xiàn)骨骼發(fā)育性疾病、慢性腎臟衰竭和腎臟疾病在差異表達(dá)的基因中顯著富集（Figure 2C）。此外，心血管疾病比如房間隔缺如、肺動(dòng)脈高壓和家族性高脂血癥也在差異表達(dá)基因中顯著富集。特別的是， TLL1, GATA4, TBX20, INHBA, GREM1, NOX4, BMP7, LYVE1, JUN, CP, FOXC2, CETP, RXRG, CRABP2, IRS1 這些基因也包含在這些疾病中，是致病性基因，提示這些基因可能也參與房顫。

3.同位序列(HOX,同源異型盒)基因在房顫的心外膜組織中下調(diào)

    研究者將差異表達(dá)基因映射到人類基因組中，繪制了染色體7，10，11，17的基因熱圖(Figure 3A)。HOTAIRM1、HOXA4、HOXA2、HOXA3、HOXA-AS2、

HOXA6、HOXA7、HOXB7、HOXA5、HOXC6、HOXD4、HOXB6、HOXB4、HOXB-AS2、HOXB5和HOXC4這些同位序列在房顫的心外膜脂肪組織中顯著下調(diào)（(Figure 3B）。其中，HOTAIRM1, HOXA-AS2 and HOXB-AS2這三個(gè)序列是同位序列基因簇中的反義RNA，它不編碼蛋白質(zhì)。HOTAIRMI和HOXA-AS2位于HOXA基因簇上，而HOXB-AS2位于HOXB上面（Figure 3C）。眾所周知，HOX基因簇上的反義RNA可以調(diào)節(jié)正義蛋白編碼基因的表達(dá)，說明這些同位序列基因的下調(diào)可能與其中的同位序列反義RNA有關(guān)。除此之外，據(jù)報(bào)道，同位序列基因可以促進(jìn)心臟發(fā)育，說明這些基因的失活可能與房顫所致心臟損傷有關(guān)。

4. 差異表達(dá)的LncRNA在炎癥相關(guān)信號(hào)通路中最常見

就房顫心外膜脂肪組織中失調(diào)的LncRNA的功能在房顫發(fā)病機(jī)制中的作用目前仍然未知。因此研究者首先進(jìn)行了失調(diào)的LncRNA和PCGs之間關(guān)聯(lián)性的分析。接下來，進(jìn)行基因集富集分析來識(shí)別這些非編碼RNA的通路。值得注意的是，LncRNA共參與15種信號(hào)通路，而這些通路大多數(shù)是與炎癥相關(guān)的通路。其中TNF和NOD樣受體信號(hào)通路在房顫心外膜脂肪組織中是最常見的通路（Fig.4A,FDR<0.05）。研究者發(fā)現(xiàn)LINC00694、RP11?243J16.7、RP11?535C21.3、RP11?20B24.7、RP11?603J24.17、RP11?1057B6.1、RP1?267L14.3、和RP11?888D10.4這些差異表達(dá)的LncRNA與TNF信號(hào)通路緊密相關(guān)（Fig.4B, FDR < 0.05）。這些結(jié)果表明，LncRNA可能通過調(diào)控炎癥通路的活動(dòng)而參與房顫的發(fā)病機(jī)制。

5. 功能性LncRNA參與與蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的通路

    為了進(jìn)一步探索失調(diào)的LncRNA的功能，研究者通過整合方式預(yù)測(cè)了LncRNA-PCGs關(guān)聯(lián)體。首先，LncRNA和PCGs編碼的蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)由深度研究方法來預(yù)測(cè),在上調(diào)和下調(diào)基因列表上共現(xiàn)性的基因也被考慮在內(nèi)。在上調(diào)的LncRNA中，發(fā)現(xiàn)SNHG16和RP11-471B22.2與22種PCGs相關(guān)(Fig.5A)。而且，任何已知的LncRNA和某些通路之間的聯(lián)系是由相關(guān)聯(lián)的PCGs來連接的。值得注意的是，BAMBI和INHBA參與TGFβ信號(hào)通路，而SNHG16和BAMBI和INHBA高度相關(guān) (Fig. 5B）。此外，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)RP11-471B22.2可以通過與膠原蛋白如COL4A3和COL4A4關(guān)聯(lián)來調(diào)控ECM-受體交互作用。總的來說，這些結(jié)果表明SNHG16和RP-471B22.2可能通過與某些蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)而分別參與調(diào)控TGF-β和ECM-受體交互作用。

研究也發(fā)現(xiàn)，同位序列基因（HOX）在房顫中顯著下調(diào)，這些下調(diào)的同位序列可能與那些同位序列中的反義RNA相關(guān)。值得注意的是，同位序列HOXA5在小鼠中通過抑制TNC/TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)促進(jìn)白色脂肪組織棕色化。此外，據(jù)報(bào)道，同位序列可以促進(jìn)心臟發(fā)育。因此，研究者推測(cè)同位序列的失調(diào)可能導(dǎo)致心臟祖細(xì)胞的失活，從而導(dǎo)致了房顫的發(fā)生。對(duì)這些失調(diào)的LncRNA進(jìn)行生物功能學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，LINC00694、RP11?243J16.7、RP11?535C21.3、RP11?20B24.7、RP11?603J24.17、RP11?1057B6.1、RP1?267L14.3、和RP11?888D10.4與TNF信號(hào)通路緊密相關(guān)，此外，SNHG16和 RP11-471B22.2可能通過與通路中的蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)而分別參與TGF-β信號(hào)通路和ECM受體交互作用。因此研究者推測(cè)SNHG16和RP11-471B22.2這兩種LncRNA可能與一些蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)，這些蛋白質(zhì)包括BAMBI, INHBA, COL4A3, and COL4A4，這種關(guān)聯(lián)具有增強(qiáng)或者減弱某些蛋白和通路的活動(dòng)的作用。TNF和TGF-β信號(hào)與炎癥相關(guān)通路有關(guān)，比如氧化應(yīng)激、凋亡、纖維化的病理過程，而這些都可以促進(jìn)房顫基質(zhì)的形成。

    此外，本研究也存在一些缺陷，如缺少對(duì)功能性LncRNA的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、樣本量小以及缺少對(duì)LncRNA潛在機(jī)制的進(jìn)一步探索。但是，本研究提供了房顫中潛在的一些致病性LncRNA,這些發(fā)現(xiàn)為同領(lǐng)域的研究者進(jìn)行更深層次的功能學(xué)研究和在房顫管理中開發(fā)新的治療方法提供了幫助。

研究亮點(diǎn)：

1. 通過對(duì)心外膜脂肪組織中的RNA序列數(shù)據(jù)分析從而揭示了房顫中差異表達(dá)的蛋白編碼基因和長鏈非編碼RNA。

2. 同位序列基因(HOX genes)在房顫中顯著下調(diào)。

3. 失調(diào)的長鏈非編碼RNA揭示了TNF信號(hào)通路在房顫中是最重要的。

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