編譯：楊峰，編輯：十九、江舜堯。
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衰老是一個高度復(fù)雜的生物學(xué)過程，通常伴隨著組織功能的普遍下降，以及與衰老相關(guān)疾病的風(fēng)險增加，如心血管疾病、中風(fēng)、癌癥和神經(jīng)退行性疾病。事實上，隨著平均壽命的不斷增加，與衰老相關(guān)的功能衰退，如認(rèn)知障礙，將可能成為以后在醫(yī)療保健中需要優(yōu)先考慮的事項。例如，最常見的癡呆形式是阿爾茨海默?。?/span>AD），但在老年人群中很大一部分的認(rèn)知障礙不是AD，而是正常的衰老過程。因此，確定在衰老過程中保持機(jī)體功能完整性的方法是非常重要的。人們已經(jīng)提出了許多理論來解釋我們?yōu)槭裁醋兝?。最近，研究者提出了一種新的理論猜想，認(rèn)為衰老是人體微循環(huán)持續(xù)受損的過程。事實上，有可靠的證據(jù)表明血液中的系統(tǒng)性因素可以極大地逆轉(zhuǎn)衰老相關(guān)的損傷，它們受到特定的使更年輕或變衰老的因子的影響，例如蛋白質(zhì)、microRNAs（miRNAs）和mRNAs。因此，許多循環(huán)因子被鑒定為組織特異性疾病和衰老的有吸引力的生物標(biāo)志物。然而，血液衍生因子對衰老的作用機(jī)制仍不清楚。
過去二十年的研究表明，細(xì)胞主要通過釋放細(xì)胞外囊泡（EV）進(jìn)行通訊，這些囊泡可以作用于附近的細(xì)胞（旁分泌信號）或最終進(jìn)入循環(huán)體液，并可能在遠(yuǎn)處產(chǎn)生影響（內(nèi)分泌信號）。外泌體是小的EV（直徑約50-150nm），主要來源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體。事實上，外泌體包含許多特定的蛋白質(zhì)，mRNAs，miRNAs和長非編碼RNAs，并通過在源細(xì)胞和靶細(xì)胞之間轉(zhuǎn)運其貨物的方式在細(xì)胞通訊中發(fā)揮重要作用，這在衰老和與衰老相關(guān)的疾病中也很重要。例如，將年輕小鼠的血清外泌體注射到年老小鼠體內(nèi)可以改變衰老相關(guān)分子的表達(dá)模式，以模仿年輕小鼠的表達(dá)模式。此外，研究表明，腦細(xì)胞外泌體可以跨越血腦屏障（BBB），作為AD認(rèn)知障礙的外周循環(huán)生物標(biāo)志物，而且，血液外體也可以穿過血腦屏障，靶向腦細(xì)胞并影響腦功能。因此，外周循環(huán)外泌體具有診斷和治療的潛力。然而，大多數(shù)的研究都集中在建立比較疾病狀態(tài)和相對應(yīng)的健康狀態(tài)的外泌體蛋白或miRNA圖譜上，很少有研究關(guān)注正常衰老過程中外周循環(huán)外泌體中蛋白質(zhì)和miRNAs的特征。因此，明白能從外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的外泌體蛋白和miRNAs的分布是非常重要的。重要的是，據(jù)有關(guān)估計miRNAs通過促進(jìn)其mRNAs的降解或抑制其翻譯來調(diào)節(jié)約31%的真核基因。事實上，miRNA可以調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫、壽命、細(xì)胞增殖、凋亡和發(fā)育，以及病理過程，如癌癥、心血管和神經(jīng)退行性疾病。因此，在轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞的外體貨物中，miRNAs可能對細(xì)胞功能的下游影響最大。為了探討循環(huán)外泌體在衰老過程中的作用，外泌體miRNAs必須有更廣泛的表征。此外，最近的證據(jù)表明許多信號通路調(diào)節(jié)正常的衰老過程。然而，關(guān)于衰老如何影響外泌體miRNAs和mRNAs的共表達(dá)譜，以及miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對衰老過程的系統(tǒng)影響的研究還很缺乏。
為了解決人們對外泌體miRNA功能認(rèn)識上的不足，研究者使用高通量測序技術(shù)建立了年幼的和年老的老鼠來源的循環(huán)外泌體的miRNA和mRNA表達(dá)譜。此外，研究者還利用生物信息學(xué)工具，包括GO分析、KEGG分析、KOG功能分類和IPA分析等，分析了miRNA靶點的生物學(xué)重要性和與衰老相關(guān)的主要信號通路，通過這些研究去深入探究了外泌體miRNA可能存在的作用。研究者的發(fā)現(xiàn)可能為理解與衰老相關(guān)的循環(huán)miRNAs組成變化的生理后果提供基礎(chǔ)資料，并可能引起對衰老相關(guān)的疾病的潛在干預(yù)。
論文ID
原名：Peripheral Circulating Exosomal miRNAs Potentially Contribute to the Regulation of Molecular Signaling Networks in Aging
譯名：外周循環(huán)外泌體miRNA可能有助于分子信號網(wǎng)絡(luò)在衰老過程中的調(diào)控
期刊：International Journal of Molecular Sciences
IF：4.2
發(fā)表時間：2020年3月11日
通訊作者：Hongxia Zhang & Kunlin Jin
作者單位：美國北德克薩斯大學(xué)沃思堡健康科學(xué)中心
結(jié)果
血清外泌體的特征描述
研究者首先用Western blotting法測定了年幼和年老的大鼠血清外泌體中的蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示：血清外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD9在年幼和年老的大鼠中都成陽性。NTA分析證實外泌體粒徑范圍在40-120nm，平均值為82±0.8nm，這是之前研究報道的外泌體粒徑在70-120nm處達(dá)到峰值的報道是一致的。此外，用透射電鏡(TEM)證實了純化后的顆粒具有膜結(jié)合，在尺寸上是圓形和非均質(zhì)的(40~120nm)。
Fig1：血清外泌體的特征描述
和年齡相關(guān)的血清外泌體RNA的差異表達(dá)
為了確定衰老是否影響血清外泌體RNA的表達(dá)水平，采用高通量RNA測序技術(shù)測定了RNA的表達(dá)譜。經(jīng)過質(zhì)量控制和去除冗余，共有35117個RNA，包括mRNA、miRNAs和其它類型的RNA，從年幼的和年老的大鼠血清外泌體中鑒定出來。在采用顯著性分析后，在被鑒定的15272個mRNA中，來自年老的大鼠的血清外泌體共有2736個下調(diào)，占總數(shù)的17.9%，有108個上調(diào)，占總數(shù)的7%。此外，在質(zhì)量控制后，有600個miRNA被鑒定出來，其中68個在年老的大鼠中含量豐富，在這68個miRNA中，來自年老的大鼠的血清外泌體的有20個miRNA下調(diào)，48個miRNA上調(diào)?；鹕綀D和聚類分析揭示了在利用targetscan網(wǎng)站分析后的和衰老相關(guān)的血清外泌體差異表達(dá)的mRNAs和miRNAs的整體分布情況。
Fig2：年幼的和年老的大鼠血清外泌體mRNA和miRNA的表達(dá)圖譜
miRNA靶向的mRNA鑒定
miRNA調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)通過結(jié)合mRNA進(jìn)而促進(jìn)它們的降解來抑制翻譯，或者兩種作用都存在。火山圖顯示了在這項研究中研究者鑒定的外泌體miRNAs的總體分布（圖3A）。為了研究差異表達(dá)的miRNAs可能的功能作用，用Targetscan分析了它們潛在的mRNA靶點。在68個miRNA中，只有19個與和年齡相關(guān)的差異表達(dá)的2844個mRNA中的766個mRNA有關(guān)，提示這些miRNAs可能參與了特異性mRNAs的年齡依賴性調(diào)控。其中相對于年幼的大鼠，在年老的大鼠血清外泌體中有5個mRNA表達(dá)下調(diào)，14個mRNA表達(dá)上調(diào)。在miRNA方面，miRNA-483-3p和miRNA-489-3p只在年幼的大鼠外泌體中檢測到，而miRNA-187-3p、miRNA-202-3p、miRNA-450b-5p、miRNA-501-3p、miRNA-511-5p和miRNA-598-3p只在年老的大鼠外泌體中檢測到。圖3D展示了每一個樣品差異表達(dá)的miRNA的聚類分析的結(jié)果。
Fig3：年幼的和年老的大鼠血清外泌體中差異表達(dá)的miRNA圖譜
mIRNA靶向mRNA的GO富集分析
為了更好地了解這些外泌體miRNAs在衰老中的潛在作用，研究者使用Blastp對GO富集分析中確定的靶基因進(jìn)行功能注釋和富集分析。功能注釋按生物過程、細(xì)胞成分和分子功能進(jìn)行分類，僅考慮p值最小的前10個GO項。這些代表了對靶基因功能豐富的注釋，較低的p值代表了相對項的有更大的功能豐富度。值得注意的是，這些GO項下面的幾乎所有基因在年老的大鼠血清外泌體中都被下調(diào)。這項分析揭示了幾個豐富的功能分類和靶基因，包括參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾、代謝過程、細(xì)胞通訊、分子功能與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因。
Fig4：在年幼的和年老的大鼠間19個差異表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)的靶基因的GO分析、KOG功能分類和KEGG通路分析
KOG和KEGG富集分析
用KOG對在年幼的和年老的大鼠之間存在差異表達(dá)的19個miRNAs調(diào)控的mRNAs（共有766個mRNA）進(jìn)行功能分類。在由此產(chǎn)生的25個KOG分類中，參與“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”的基因是最常見的靶向基因（有151個基因），其次是“一般功能預(yù)測”（有119個基因）、“轉(zhuǎn)錄”（有56個基因）、“翻譯后修飾和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換”（有55個基因）和“細(xì)胞內(nèi)功能和分泌及囊泡轉(zhuǎn)運”（有40個基因）。
KEGG是一個功能注釋和基因組信息實際應(yīng)用的綜合性知識庫。KEGG路徑分析確定了在年幼的和年老的大鼠外泌體之間存在差異顯著的20條信號途徑。在這些途徑中，發(fā)現(xiàn)以下與衰老和壽命有關(guān)：胰島素抵抗，MAPK信號通路，PI3K-Akt信號通路，mTOR信號通路，toll樣受體信號通路，FoxO信號通路，ErbB信號通路，壽命調(diào)節(jié)信號通路，EGFR酪氨酸激酶抑制劑的抵抗通路。
Fig5：來自年幼的和年老的大鼠血清外泌體差異表達(dá)的miRNA的IPA分析
Fig6：差異表達(dá)的外泌體miRNA調(diào)節(jié)的最常見的靶基因和mTOR信號通路
通路和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析
然后研究者對在衰老期間與血清外泌體miRNAs相關(guān)的分子途徑進(jìn)行了IPA軟件分析。結(jié)果表明，163個IPA典型途徑與血清外泌體miRNAs的表達(dá)顯著相關(guān)（p<0.05）。圖5A顯示了miRNAs靶向的與衰老相關(guān)的前22個最強的途徑。研究發(fā)現(xiàn)的與衰老相關(guān)的信號通路包括胰島素、整合素、ErbB、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、mTOR、阿片類、端粒酶、PTEN、IGF-1、AMPK、生長激素、eNOS、一氧化氮、FGF、cAMP、鞘氨醇、PDGF、DHA、TREM1和p53，提示miRNAs能夠靶向調(diào)節(jié)衰老的多種生物途徑。
Tab1：和年齡相關(guān)的差異表達(dá)的循環(huán)miRNA列表
Tab2：和年齡相關(guān)的差異表達(dá)的19個miRNA靶向基因的IPA分析
圖5B顯示了IPA分析網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果，表2列出了miRNAs參與的9種途徑。與IPA的結(jié)果類似，這些作用網(wǎng)絡(luò)包含的基因被預(yù)測與新陳代謝、生長激素信號和氧化應(yīng)激有關(guān)。如圖5B所示，每個途徑都與多個基因轉(zhuǎn)錄本相連，單個基因可由多個miRNAs調(diào)節(jié)。這表明血清外泌體miRNAs調(diào)節(jié)通路間的crosstalk在年幼的和年老的大鼠中不同。網(wǎng)絡(luò)中最常見的蛋白是EIF4EBP1、INSR、PDPK1、PTEN、PXN和IGF-1R，它們被最重要的miRNAs靶向（圖6A）。整體來說，本研究的結(jié)果建立了miRNAs和它們的靶向mRNA，分子作用網(wǎng)絡(luò)和調(diào)節(jié)年幼的和年老的動物血清外泌體miRNAs組成相關(guān)的生物途徑之間可能存在的作用。圖6B展示了miRNA介導(dǎo)的調(diào)控的這樣的一個例子。
討論
在過去的二十年中，人們使用了異種血液交換技術(shù)，包括異種共生、異種血液或血漿移植，異種血漿分離，作為研究衰老生物學(xué)的工具。事實上，從年幼的動物到年老的動物的異種血液交換導(dǎo)致了年輕化，而在一只年幼的動物中，用一只年老動物的異種血液交換后，觀察到年幼動物會加速衰老。為了探討其作用機(jī)制，研究者用Exo-NGS技術(shù)分析比較了年幼和年老大鼠血清外泌體中mRNAs和miRNAs的表達(dá)譜。研究者在年幼和年老大鼠的血清外泌體中鑒定出68個miRNA和2844個mRNA。與mRNAs相比，人們對miRNA在衰老過程中的豐度變化知之甚少。因此，研究者將重點放在循環(huán)miRNAs上，它可以作為衰老相關(guān)疾病的潛在生物標(biāo)記物和治療靶點。為了確定這些循環(huán)miRNA是如何影響衰老的，鑒定每個miRNA的靶點是很重要的。本研究的數(shù)據(jù)顯示，在鑒定的68個差異表達(dá)的血清外泌體miRNA中，基于TargetScan分析，有19個被預(yù)測為靶向766個差異表達(dá)的mRNA，在19個miRNAs中，年老大鼠外泌體中有14個比年幼大鼠豐富，有5個不太豐富。這些結(jié)果與報道的14個miRNAs中大多數(shù)的豐度一致，包括miR-150-3p、miR-378-3p、miR-199a-5p、miR-145-5p、miR-598-3p、miR-122-5p、miR-194-5p、miR-203a-3p、miR-202-3p、miR-145-5p和miR-532-5p，這些都在年老的人、小鼠和大鼠的血液或組織樣本中表達(dá)上調(diào)。本研究的數(shù)據(jù)也證實了miR-181a-5p和miR-133a-3p隨年齡增長而降低。這14個與衰老有關(guān)的miRNA，其中一些miRNA的表達(dá)與癌癥、長壽、炎癥反應(yīng)以及與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病和心臟病有關(guān)?？偟膩碚f，大多數(shù)差異表達(dá)的miRNAs的豐度先前已經(jīng)被報道隨著年齡的增長而改變，這表明這些miRNAs在壽命中可能會發(fā)揮作用。有趣的是，在年老大鼠血清外泌體中miR-181a-5p的下調(diào)與促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在恒河猴血清中與抗炎細(xì)胞因子TGFβ和IL-10呈正相關(guān)。尤其是，IL-6和TNF-α的豐度與衰老相關(guān)。因此，某些外泌體miRNAs可能通過調(diào)節(jié)全身炎癥而導(dǎo)致衰老，這些miRNAs的組成可能是衰老的生物學(xué)特征。
研究者使用Blastp和GO對miRNA調(diào)控基因進(jìn)行功能注釋，并確定了隨著年齡的增長，外泌體miRNA豐度變化而改變的生物學(xué)過程。在這些過程中，最具代表性和最豐富的是蛋白質(zhì)翻譯后修飾、代謝過程、細(xì)胞通訊、分子功能和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這意味著這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)靶基因在衰老和多種生物學(xué)過程之間提供了重要的聯(lián)系。KEGG通路分析顯示，這些miRNA靶向的mRNAs富含已知的與衰老相關(guān)的信號通路。GO和KEGG分析還顯示，大多數(shù)miRNA靶向的mRNA都參與了對衰老至關(guān)重要的信號通路和生物過程，這表明循環(huán)miRNAs可能有助于調(diào)節(jié)衰老的速率，因此可能是潛在的衰老生物標(biāo)志物。任何單個miRNA都有可能作用于許多靶基因，因此，多個miRNA有可能調(diào)節(jié)許多生物途徑。因此，通過檢測miRNAs之間的協(xié)同作用，可以最有效地評估m(xù)iRNAs對任何特定途徑的影響。為了進(jìn)一步研究單個miRNA-mRNA的相互作用是如何調(diào)節(jié)衰老相關(guān)的通路的，研究者進(jìn)行了IPA軟件分析，發(fā)現(xiàn)表達(dá)變化的循環(huán)miRNA靶向于胰島素、整合素、mTOR、AMPK、PTEN、IGF-1、生長激素、eNOS和p53調(diào)控的信號通路，這是衰老和壽命的關(guān)鍵途徑。例如，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-187-3p可以調(diào)節(jié)INSR的mRNA，miRNA-378a-3p和miRNA-202-3p可以調(diào)節(jié)IGF-1R mRNA。研究表明miRNA-187水平與葡萄糖刺激的胰島素分泌呈負(fù)相關(guān)，miRNA-378a可能在胰島素抵抗和肥胖中起作用。胰島素/IGF-1途徑在許多物種的衰老和壽命中起著關(guān)鍵作用。有證據(jù)表明，降低循環(huán)IGF-1水平或降低IGF-1R的表達(dá)可延長小鼠的壽命； 此外，IGF-1受體一個等位基因的缺失可使小鼠的壽命延長33%。研究者還發(fā)現(xiàn)miR-187-3p、miR-202-3p和miR-378a-3p調(diào)節(jié)INSR、EIF4EBP1和PDK1的mRNA水平，其基因被mTOR信號通路靶向。mTOR通路整合了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號，是細(xì)胞代謝、增殖和存活的中樞調(diào)節(jié)器，通過激活p70S6K和抑制翻譯抑制因子eIF4EBP調(diào)節(jié)翻譯來控制壽命。例如，敲除三個翻譯調(diào)控因子，即eIF4E、eIF4G和eIF2B同源物，延長了秀麗隱桿線蟲的壽命，以及通過一種顯性負(fù)性的TOR方式調(diào)節(jié)它們的mRNA翻譯來延長壽命。最近的研究表明：雷帕霉素mTOR抑制劑能顯著延長不同品系小鼠的壽命。通過mTOR或胰島素/IGF-1的信號傳導(dǎo)減少對壽命的影響還沒有明確的解釋。然而，一個可能的解釋是在抑制了這些信號通路中任何1個之后，機(jī)體的mRNA翻譯減少，這樣它可以減少與蛋白質(zhì)折疊、修復(fù)和降解相關(guān)的負(fù)擔(dān)和能量需求，從而保持更好的機(jī)體蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。目前研究者的發(fā)現(xiàn)支持這個假設(shè)。
除了胰島素/IGF-1和mTOR途徑外，許多其他信號途徑，如PTEN途徑，也調(diào)節(jié)壽命。事實上，PTEN通過其抗氧化活性和對熱量的限制，以及參與DNA損傷減少、DNA復(fù)制抑制和腫瘤抑制，對延長人類壽命具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)miR-203b-3p可以靶向PTEN。
值得注意的是，諸如胰島素/IGF-1、mTOR和PTEN等信號通路可能單獨調(diào)節(jié)衰老和壽命。然而，這些信號網(wǎng)絡(luò)不是自主的，而是通過一些特定的媒介連接起來的。例如，mTOR有兩個復(fù)合物mTORC1和mTORC2，mTORC1受Akt調(diào)節(jié)，mTORC2是Akt激活劑。PI3激酶信號激活mTORC2，mTORC2又激活許多其他激酶，包括PKCα。一貫地，研究者發(fā)現(xiàn)，EIF4EBP1、INSR、PDPK1、PTEN、PXN和IGF1R存在重合的作用并受至少兩個循環(huán)miRNAs調(diào)節(jié)，并且這些通路中的每一個途徑在衰老過程中都可能發(fā)揮獨特的作用。
綜上所述，本研究的發(fā)現(xiàn)表明，隨著年齡的增長，循環(huán)外泌體miRNAs的組成變化不僅可以被認(rèn)為是動物年齡的一個潛在預(yù)測因素，而且可能有助于通過調(diào)節(jié)衰老和壽命的幾個關(guān)鍵信號途徑來影響衰老。識別和理解年輕化和加速衰老的機(jī)制很重要，因為有關(guān)年輕化的發(fā)現(xiàn)可能逆轉(zhuǎn)衰老的發(fā)生過程，而有關(guān)加速衰老的發(fā)現(xiàn)可能為相關(guān)的干預(yù)措施，指明可能減緩衰老速率和衰老相關(guān)疾病發(fā)生率的潛在途徑。未來的挑戰(zhàn)將是確定這些因子如何映射到不同的途徑上并相互作用，以及如何解釋它們在衰老的分子機(jī)制中的作用。
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