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編譯：熱血本能，編輯：十九、江舜堯。

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首先研究者采用RNA-seq法檢測了3對胃癌組織及癌旁組織中circRNA的表達(dá)(圖1a)。在這些樣本中總共識別出了57623個不同的環(huán)狀RNA，其中35120個環(huán)狀RNA至少包含兩個獨立的反向剪接reads (圖1b)。通過與circBase相比，結(jié)果中有29007個匹配的環(huán)狀RNA和28616個新的環(huán)狀RNA。其中大多數(shù)外顯子環(huán)狀RNA小于1500個核苷酸(nt)，中位長度約為500個nt (圖1c)。接下來，作者又使用RefSeq數(shù)據(jù)庫對這些確定的circRNA候選項進行了注釋。發(fā)現(xiàn)這些環(huán)狀RNA大部分來源于外顯子，其他環(huán)狀RNA與內(nèi)含子、3 -UTR、5 -UTR、基因間區(qū)、反義序列等排列(圖1d)。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中有13個候選環(huán)狀RNA被顯著下調(diào)，9個被上調(diào)(圖1e)，作者進一步通過qRT-PCR檢測30對胃癌及癌旁組織中候選環(huán)狀RNA的表達(dá)。結(jié)果顯示有9個環(huán)狀RNA具有統(tǒng)計學(xué)差異，其中來自MRPS35基因外顯子2、3、4、5的hsa_ circ_0000384的p值最小。為了進一步闡明新型環(huán)狀RNA circMRPS35的特性，研究者設(shè)計了發(fā)散引物和聚合引物分別對反向拼接產(chǎn)物和線性擴增產(chǎn)物進行擴增(圖1g)。從圖1h可以清楚的看出，不同的引物在cDNA中擴增出circMRPS35，而在gDNA中擴增不出circMRPS35。并且外顯子2和外顯子5的頭尾拼接經(jīng)Sanger測序證實(圖1i)。鑒于環(huán)狀RNA沒有poly-A尾巴，作者在逆轉(zhuǎn)錄PCR過程中使用了random和oligo dT引物。從圖1j可以看出，Oligo dT引物轉(zhuǎn)錄的circMRPS35的逆轉(zhuǎn)錄量要比隨機引物轉(zhuǎn)錄的少很多。從圖1k可以看出，circMRPS35相對于MRPS35的線性mRNA更能抵抗RNase R的消化。圖1l顯示，在MKN45細(xì)胞中，經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D處理后，circMRPS35明顯比MRPS35 mRNA更穩(wěn)定。結(jié)果顯示，circMRPS35是一個穩(wěn)定的circRNA，并且在胃癌組織中表達(dá)量較低。

圖1：人胃癌組織中環(huán)狀RNA (circMRPS35)的鑒定與驗證

2. CircMRPS35的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)

隨后研究者為了評價circMRPS35表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，對160對胃癌及其癌旁組織進行了原位雜交(ISH)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circMRPS35在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(圖2a和2b)。circMRPS35表達(dá)水平與腫瘤晚期轉(zhuǎn)移(TNM)、淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)(圖2c-2e)。受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析顯示，基于circMRPS35的預(yù)測曲線下面積為0.6976，說明circMRPS35可用于預(yù)測患者的預(yù)后(圖2f)。為了確定ROC曲線生成后的最佳截斷值，找到了敏感性和特異性之間的平衡。為了使敏感性和特異性最大化，引入了約登指數(shù)，即最大值=敏感性+特異性- 1。由ROC曲線可知，當(dāng)敏感性為77.23%，特異性為59.32時，約登指數(shù)最大。因此，此時circMRPS35表達(dá)的值是決定高表達(dá)水平或低表達(dá)水平的最佳截斷值。從圖2g可以清楚的看出，circMRPS35的低表達(dá)與胃癌患者生存時間的縮短密切相關(guān)。因此，circMRPS35在胃癌中具有明顯的臨床意義。

圖2: CircMRPS35表達(dá)與胃癌患者預(yù)后良好相關(guān)

3. CircMRPS35在體外抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

為了評價circMRPS35的功能，研究者使用qRT-PCR方法檢測了circMRPS35在人胃癌細(xì)胞系和GES-1細(xì)胞中的表達(dá)情況。圖3a顯示，circMRPS35水平在SGC7901和MKN28細(xì)胞中相對較低，而在MGC803和MKN45細(xì)胞中相對較高。將其過表達(dá)質(zhì)粒pCDH-CMVCircMRPS35轉(zhuǎn)染SGC7901和MKN28細(xì)胞后，CircMRPS35較pCDH-CMV-Control載體明顯升高，而MRPS35 mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化(圖3b)。圖3c和d顯示，circMRPS35在G1期顯著抑制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。圖3e進一步揭示了circMRPS35抑制胃癌細(xì)胞侵襲的作用。此外，研究人員還設(shè)計了針對circMRPS35的反向剪接位點的siRNAs，這些siRNAs顯著降低了circMRPS35的表達(dá)，但對MRPS35的mRNA和蛋白表達(dá)沒有影響(圖3f和3g)。此外，敲除circMRPS35可顯著促進MGC803和MKN45細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期加速和侵襲(圖3h-j)。總之，這些結(jié)果明確證實了circMRPS35在體外可以調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的行為。

圖3：CircMRPS35在體外抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移

4. CircMRPS35在體內(nèi)抑制胃癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移

當(dāng)然，研究人員隨后檢測了CircMRPS35在體內(nèi)對胃癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。為了進一步闡明circMRPS35在體內(nèi)的作用，研究者構(gòu)建了具有circMRPS35增減功能的穩(wěn)定的胃癌細(xì)胞系。如圖4a-c所示，circMRPS35可降低異種移植小鼠的腫瘤生長和體重。并通過免疫組織化學(xué)染色(IHC)進一步表明，在circMRPS35過表達(dá)的腫瘤中，Ki-67和PCNA表達(dá)降低(圖4d)。進一步研究表明，shRNA慢病毒下調(diào)MGC803中的CircMRPS35可增加腫瘤生長、腫瘤重量，增加Ki-67和PCNA的表達(dá)(圖4e-h)。此外，小型動物活體成像系統(tǒng)和HE染色結(jié)果顯示，circMRPS35在體內(nèi)顯著減少了裸鼠肺部的轉(zhuǎn)移灶(圖4i-l)。并且circMRPS35的下調(diào)增加了裸鼠肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量(圖4m-p)。這些結(jié)果進一步證實了circMRPS35在體內(nèi)能夠抑制胃癌的生長和轉(zhuǎn)移。

圖4：CircMRPS35的表達(dá)抑制了胃癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移

5. CircMRPS35通過轉(zhuǎn)錄激活FOXO1和FOXO3a來抑制胃癌的進展

為了探討circMRPS35抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的機制，研究者隨后通過RNA-seq分析來闡明circMRPS35敲除后的基因表達(dá)譜。通過GO富集和KEGG通路分析表明，在參與腫瘤的circMRPS35調(diào)控信號通路中，FOXO信號通路的相關(guān)性最強(圖5a)。由于FOXO家族在哺乳動物中進化保守，由FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6 4個成員組成。外源性表達(dá)circMRPS35后檢測其表達(dá)情況。圖5b-d顯示，circMRPS35顯著提高了FOXO1和FOXO3a的mRNA和蛋白水平，但對FOXO4和FOXO6無明顯影響。然而，CircMRPS35基因敲除對FOXO1和FOXO3a的磷酸化無明顯影響。已有研究證實FOXO1的靶基因為p21和p27， FOXO3a的靶基因為Twist1、E-cadherin、Snail和Y-box binding protein 1 (YB-1)。圖5e-f顯示，circMRPS35相應(yīng)改變了p21、p27、Twist1和E-cadherin的表達(dá)，而對Snail和YB-1沒有明顯的影響。此外，FOXO1的減少顯著減弱了circMRPS35的表達(dá)，促進了p21和p27的表達(dá)，緩解了SGC7901細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和增殖抑制(圖5g-i)。FOXO3a敲低降低了circMRPS35誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)，挽救了circMRPS35誘導(dǎo)的Twist1表達(dá)抑制和細(xì)胞侵襲(圖5j和k)。熒光原位雜交(FISH)顯示circMRPS35主要定位于SGC7901和MGC803細(xì)胞的細(xì)胞核中(圖5l)，并通過核質(zhì)RNA的分離分析進一步證實了這一點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎?/span>circMRPS35顯著提高了FOXO1和FOXO3a的啟動子活性(圖5n-5o)。綜上所述，結(jié)果顯示circMRPS35通過轉(zhuǎn)錄激活FOXO1和FOXO3a來抑制胃癌細(xì)胞的行為。

圖5：CircMRPS35通過上調(diào)FOXO1和FOXO3a的轉(zhuǎn)錄活性來抑制胃癌的進展

6. CircMRPS35在胃癌組織中的表達(dá)與FOXO1和FOXO3a相似

接下來，研究者還調(diào)查了circMRPS35、FOXO1和FOXO3a在胃癌組織中的臨床相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1或FOXO3a在胃癌組織中的表達(dá)均顯著降低(圖6a和6b)，并且FOXO1表達(dá)水平與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)，FOXO3a表達(dá)與TNM晚期及淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(圖6c和6d)。ROC曲線提示FOXO1和FOXO3a表達(dá)均可用于預(yù)測患者預(yù)后(圖6e和6f)。FOXO1或FOXO3a的低表達(dá)與胃癌患者的低生存期密切相關(guān)(圖6g和6h)。而且，FOXO1和FOXO3a的表達(dá)與circMRPS35的表達(dá)呈正相關(guān)(圖6j和6i)。有趣的是，circMRPS35和FOXO1或FOXO3a低表達(dá)組的生存時間最短(圖6k和6l)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)有力地說明circMRPS35介導(dǎo)的FOXO1和FOXO3a信號通路在胃癌中起著至關(guān)重要的作用。

圖6：CircMRPS35在胃癌組織中的表達(dá)與FOXO1和FOXO3a相似

7. CircMRPS35將KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子中

為了進一步研究circMRPS35-激活FOXO1和FOXO3a轉(zhuǎn)錄的機制，研究者將MGC803裂解物與生物素化的circMRPS35探針孵育，然后進行RNA下拉實驗和質(zhì)譜分析(圖7a)。可能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的候選蛋白，包括基本轉(zhuǎn)錄因子3 (BTF3)、賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶7 (KAT7)和TATA-box結(jié)合蛋白相關(guān)因子15 (TAF15)，在后續(xù)的驗證試驗中進行了評估。作者通過RIP和RNA下拉進一步證實，只有KAT7特異性地與circMRPS35結(jié)合(圖7b和7c)。通過FISH和免疫熒光結(jié)果顯示，circMRPS35與KAT7共定位于MGC803細(xì)胞核內(nèi)(圖7d)。分子對接表明，circMRPS35片段(反向剪接位點)與KAT7殘基形成多個氫鍵相互作用，包括Trp-350、Asp- 430、arg483、Gly-485、tyr486、Gly-487、lys488、Lys- 524、Ser-592(圖7e)。隨后，作者設(shè)計了標(biāo)記為flag的KAT7質(zhì)粒的不同突變來分析KAT7和circMRPS35之間的相互作用(圖7f)。RNA下拉實驗明確證實了KAT7 (256-315aa) C2H2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄渑ccircMRPS35的相互作用至關(guān)重要(圖7g)。先前的研究表明，KAT7更傾向于在賴氨酸5處乙?；?/span>H4，賴氨酸12處乙?；?/span>H3，賴氨酸14處乙?；?/span>H3。最近對人類基因組組蛋白乙?；Ｊ降难芯勘砻?，H4K5ac、H4K12ac和H3K14ac可能富集于FOXO1和FOXO3a的啟動子區(qū)域。隨后，ChIP實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MGC803細(xì)胞中，只有H4K5ac直接與FOXO1和FOXO3a的啟動子區(qū)域結(jié)合(圖7h和7i)。圖7j顯示了circMRPS35和H4K5ac在MGC803細(xì)胞核中共域化。RNA下拉和RIP實驗表明H4K5ac與circMRPS35特異性相互作用(圖7k和7l)。此外，circMRPS35、KAT7和H4K5ac的共域化被超高分辨率成像證實(圖7m)，表明circMRPS35與H4K5ac和KAT7相互作用形成三聚體復(fù)合物。作者還進一步通過RNA純化(ChIRP)法分離染色質(zhì)表明circMRPS35直接與FOXO1和FOXO3a啟動子區(qū)結(jié)合(圖7o)。這些綜合證據(jù)有力地表明，circMRPS35作為一個模塊支架將KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子中。此外，KAT7敲除減弱了circMRPS35，增加了FOXO1和FOXO3a基因啟動子中的H4K5ac水平(圖7p和7q)。最終，KAT7的下調(diào)顯著降低了circmrps35誘導(dǎo)的FOXO1和FOXO3a mRNA和蛋白的表達(dá)（圖7r和7s）。綜上所述，circMRPS35通過招募KAT7增加了FOXO1和FOXO3a啟動子區(qū)域H4K5的乙酰化水平。

圖7：CircMRPS35作為模塊支架將KAT7招募到FOXO1和FOXO3a基因的啟動子中。

8. CircMRPS35在胃癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機制。

在這個模型中, circMRPS35通過招募KAT7到FOXO1和FOXO3a基因啟動子區(qū)域作為模塊支架來改變組蛋白修飾模式, 從而增加其啟動子區(qū)H4K5的乙酰化, 最終改變下游基因p21、p27、Twist1和E-cadherin的表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

圖8：CircMRPS35在胃癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機制

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