編譯：Champion，編輯：夏甘草、江舜堯。
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論文ID
原名：Circ-MALAT1 Functions as Both an mRNA T ranslation Brake and a microRNA Sponge to Promote Self-Renewal of Hepatocellular Cancer Stem Cells
譯名：Circ-MALAT1作為mRNA制動(dòng)器和microRNA海綿，促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的自我更新
期刊：Advanced Science
IF：15.84
發(fā)表時(shí)間：2019.12.21
通訊作者：Mao Chunbin&Liu Shanrong
通訊作者單位：美國俄克拉荷馬大學(xué)&同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院
DOI號(hào)：10.1002/advs.201900949
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
結(jié)果
1 Circ-MALAT1在肝細(xì)胞CSCs中高表達(dá)
為了揭示CSCs和癌細(xì)胞之間的circRNA表達(dá)差異，研究人員采用circRNA-seq進(jìn)行分析。首先從患者實(shí)體瘤中分離肝癌細(xì)胞（HCC）原代細(xì)胞，并通過懸浮培養(yǎng)獲得CSCs。然后通過CircRNA-seq對(duì)CircRNA轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表征。與貼壁細(xì)胞相比，193個(gè)circRNA轉(zhuǎn)錄本在肝細(xì)胞CSCs中異常表達(dá)（圖1A）。在差異表達(dá)的環(huán)狀RNA中，2個(gè)在所有CSCs樣本中下調(diào)，包括circMALAT1在內(nèi)的18個(gè)環(huán)狀RNA中至少3對(duì)發(fā)生異位表達(dá)（圖1B）。
隨后，進(jìn)一步評(píng)估了其中9個(gè)環(huán)狀RNA的異位表達(dá)。發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA確實(shí)是帶有頭-尾剪接的結(jié)構(gòu)（圖1C）。進(jìn)一步證實(shí)9個(gè)候選環(huán)狀RNA對(duì)RNAse R具有抗性，驗(yàn)證環(huán)狀RNA的環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)，排除反式剪接和基因組重排的可能性。（圖1D），在這9個(gè)候選基因中，circ-MALAT1在HCC原代細(xì)胞和細(xì)胞系中的CSCs表達(dá)水平均顯著高于匹配的貼壁細(xì)胞，因此選擇用于進(jìn)一步研究（圖1E）。
2 circ-MALAT1在AUF1的介導(dǎo)下促進(jìn)了HCC中CSCs的自我更新。
接下來探索肝細(xì)胞CSCs中circ-MALAT1生物發(fā)生的潛在機(jī)制。首先使用了web工具CircInteractome鑒定與circ-MALAT1側(cè)翼區(qū)結(jié)合的剪接相關(guān)因子。分析CSCs和貼壁細(xì)胞之間相關(guān)蛋白的表達(dá)。在前3位候選RNA結(jié)合蛋白中，CSCs中AUF1 mRNA表達(dá)上調(diào)2倍以上，而AGO2和FUS豐度無變化（圖2A）。通過蛋白免疫印跡試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞CSCs中AUF1蛋白表達(dá)顯著增加。使用AUF1抗體的RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）試驗(yàn)和qRT-PCR分析表明，AUF1蛋白結(jié)合pre-circ-MALAT1（圖2B）。為了進(jìn)一步確定AUF1在circ-MALAT1生物發(fā)生中的作用，使用小干擾RNA（siRNA）沉默Huh7細(xì)胞中的AUF1，發(fā)現(xiàn)AUF1敲除顯著降低circ-MALAT1的表達(dá)（圖2C）。為了揭示circ-MALAT1在肝細(xì)胞CSCs中的作用，構(gòu)建了circRNA特異性過表達(dá)質(zhì)粒。此外，選擇circ-SPARC作為陰性對(duì)照，其在CSCs和貼壁細(xì)胞之間無顯著差異。用發(fā)散引物qRT-PCR證實(shí)circ-MALAT1和circ-SPARC的特異性過表達(dá)。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU成像分析，在Hep3B和Huh7細(xì)胞中或circ-SPARC后，未檢測到對(duì)細(xì)胞增殖的明顯影響。此外，細(xì)胞周期進(jìn)程或transwell侵襲試驗(yàn)均顯示過表達(dá)circ-MALAT1或circ-SPARC的Hep3B和Huh7細(xì)胞無顯著變化。然后建立穩(wěn)定過表達(dá)circRNA的HCC細(xì)胞，鋪板進(jìn)行腫瘤球體檢測。在功能上，circ-MALAT1過表達(dá)的細(xì)胞比空對(duì)照組形成更多的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)腫瘤球體，而過表達(dá)circ-SPARC的細(xì)胞與空載體之間未見明顯差異（圖2D）。接下來，評(píng)估了過表達(dá)circ-MALAT1的Huh7細(xì)胞的異種移植腫瘤的生長。與對(duì)照細(xì)胞（Vector和circ-SPARC O/E）相比，體內(nèi)注射circ-MALAT1過表達(dá)細(xì)胞(circ-MALAT1 O/E)導(dǎo)致腫瘤體積更大（圖2E，左圖）、腫瘤重量更高（圖2E，中圖）和腫瘤生長速率更快（圖2E，右圖）。這些發(fā)現(xiàn)表明circ-MALAT1在AUF1的介導(dǎo)下促進(jìn)了HCC中CSCs的自我更新。
圖2 Circ-MALAT1促進(jìn)肝細(xì)胞CSCs的自我更新。（A）RNA結(jié)合蛋白AUF1的mRNA在Hep3B CSCs中上調(diào)。通過蛋白免疫印跡法分析Hep3B細(xì)胞和CSCs中的AUF1蛋白。通過腫瘤球?qū)嶒?yàn)富集CSCs。（B）使用Huh7細(xì)胞裂解物和抗AUF1或IgG作為IP抗體進(jìn)行RIP。使用pre-circ-MALAT1特異性引物，通過qRT-PCR分析RIP純化的RNA。（C）AUF1在Huh7細(xì)胞中被兩個(gè)獨(dú)立的siRNAs（si-AUF1-1和si-AUF1-2）沉默。沉默Huh7細(xì)胞AUF1后circ-MALAT1表達(dá)下降。（D）左圖，circ-MALAT1過表達(dá)(circ-MALAT1 O/E)、circ-SPARC過表達(dá)(circ-SPARC O/E)或載體對(duì)照(vector)Hep3B細(xì)胞球體的明亮圖像。右圖，每1000個(gè)細(xì)胞中初級(jí)、次級(jí)和三級(jí)球體數(shù)量的定量）統(tǒng)計(jì)。比例尺，200μm。（E）稀釋Circ-MALAT1過表達(dá)（Circ-MALAT1 O/E、Circ-SPARC過表達(dá)（Circ-SPARC O/E）和載體對(duì)照（vector）Huh7細(xì)胞，分別皮下植入5只BALB/c裸鼠。腫瘤接種后14d每3d觀察1次腫瘤，為期1個(gè)月。
3 circ-MALAT1可以導(dǎo)致肝細(xì)胞CSCs中JAK2上調(diào)和PAX5下調(diào)。
為了了解circ-MALAT1調(diào)控肝細(xì)胞CSCs自我更新的機(jī)制，重點(diǎn)研究了circ-MALAT1相關(guān)的下游蛋白。對(duì)1358種人抗體進(jìn)行了基于抗體陣列的分析。用circ-MALAT1質(zhì)?；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞制備蛋白。circMALAT1過表達(dá)分別識(shí)別224和43個(gè)蛋白上調(diào)和下調(diào)（圖3A）?；贕O分析，224個(gè)上調(diào)蛋白中發(fā)現(xiàn)96個(gè)與CSCs自我更新或腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)（圖3B，左圖）。
在富集倍數(shù)最顯著的3個(gè)GO數(shù)據(jù)中，選擇倍數(shù)變化最高的5個(gè)蛋白（FGF2、TGFB1、PTK2、JAK2和GH1）作為進(jìn)一步受試者。此外，43個(gè)下調(diào)蛋白中的10個(gè)參與腫瘤抑制，因此選擇用于后續(xù)分析（圖3B，右圖）。然后從circ-MALAT1過表達(dá)或空載體的Hep3B細(xì)胞中制備蛋白樣品，通過western blot分析，驗(yàn)證抗體陣列結(jié)果。發(fā)現(xiàn)與circ-MALAT1過表達(dá)相關(guān)的最顯著增加的蛋白是Janus活化激酶2（JAK2），這種蛋白，可以誘導(dǎo)CSC樣特征（圖3C）。相反，在肝癌細(xì)胞中10個(gè)下調(diào)蛋白中的5個(gè)蛋白（PAX5、ACTA1、ARFIP1、CLDN5和KRT18）中，circMALAT1過表達(dá)后PAX5下降最顯著（圖3D）。此外，使用特異性siRNA沉默circ-MALAT1（圖3E，上圖）。與過表達(dá)研究一致，circ-MALAT1敲低顯著下調(diào)JAK2蛋白表達(dá)，上調(diào)PAX5蛋白表達(dá)（圖3E，下圖）。隨后，通過western blot檢測了JAK2和PAX5在CSCs和HCC細(xì)胞系和原代細(xì)胞貼壁細(xì)胞中的表達(dá)。JAK2在肝細(xì)胞CSCs中表達(dá)顯著上調(diào)，而PAX5在CSCs中表達(dá)下調(diào)（圖3F）。而且，circ-MALAT1過表達(dá)的Huh7細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植腫瘤呈現(xiàn)較高的JAK2和較低的PAX5蛋白表達(dá)（圖3G）。總的來說，這些結(jié)果強(qiáng)烈表明circ-MALAT1可以導(dǎo)致肝細(xì)胞CSCs中JAK2上調(diào)和PAX5下調(diào)。
圖3 Circ-MALAT1表達(dá)導(dǎo)致JAK2和PAX5差異表達(dá)。（A）餅圖顯示，蛋白質(zhì)微陣列中224個(gè)蛋白上調(diào)，43個(gè)蛋白下調(diào)。（B）左圖，在上調(diào)的224個(gè)蛋白中，96個(gè)蛋白與CSCs自我更新或腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖相關(guān)。右圖，43個(gè)下調(diào)蛋白中的10個(gè)與腫瘤抑制相關(guān)。（C）在轉(zhuǎn)染circ-MALAT1過表達(dá)(circ-MALAT1 O/E)或空載體(vector)的Hep3B細(xì)胞中，通過western blot分析抗體陣列結(jié)果中的5個(gè)上調(diào)蛋白。（D）通過western blot分析，在circ-MALAT1過表達(dá)（circ-MALAT1 O/E）或空載體（vector）細(xì)胞中分析了來自抗體陣列結(jié)果的5個(gè)下調(diào)蛋白。（E）circ-MALAT1沉默的Hep3B細(xì)胞中通過western blot檢測JAK2和PAX5的蛋白表達(dá)。（F）western blot檢測2株HCC細(xì)胞株（左圖）Hep3B和Huh7及2株HCC原代細(xì)胞（右圖）CSCs和貼壁細(xì)胞JAK2和PAX5的表達(dá)。通過腫瘤球?qū)嶒?yàn)富集CSCs。（G）通過蛋白免疫印跡法測定異種移植瘤中JAK2和PAX5的表達(dá)。
4 Circ-MALAT1通過與PAX5編碼序列和核糖體結(jié)合，阻礙PAX5翻譯
已報(bào)道的研究僅顯示circRNA上調(diào)蛋白表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)circ-MALAT1過表達(dá)下調(diào)了PAX5蛋白的表達(dá)，這與之前的觀點(diǎn)相反。為了解釋發(fā)現(xiàn)的下調(diào)機(jī)制，首先進(jìn)行了熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)circ-MALAT1 circ-MALAT1只定位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核（圖4A）。然后通過qRT-PCR檢測circ-MALAT1過表達(dá)后PAX5 mRNA的表達(dá)。令人驚訝的是，circ-MALAT1過表達(dá)未見明顯變化（圖4B），這表明circ-MALAT1可能在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)PAX5發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步分析，在circ-MALAT1序列中觀察到兩個(gè)IRESs，提示circ-MALAT1與核糖體的潛在結(jié)合能力。然而，在circ-MALAT1中沒有發(fā)現(xiàn)開放閱讀框（ORF），這意味著circMALAT1沒有呈現(xiàn)編碼能力。同時(shí)，我們通過NCBI Blast發(fā)現(xiàn)circ-MALAT1中有11個(gè)堿基（557-567）與PAX5編碼序列互補(bǔ)?；谶@些分析，我們假設(shè)circ-MALAT1可能通過分別通過IRESs和11個(gè)互補(bǔ)堿基與PAX5和核糖體形成三元復(fù)合物來阻礙PAX5的翻譯（圖4C）。
為了驗(yàn)證該模型，使用circMALAT1過表達(dá)的Huh7細(xì)胞裂解物進(jìn)行RIP試驗(yàn)。首先，通過蛋白免疫印跡法確認(rèn)RPS6抗體。與對(duì)照IgG相比，抗RPS6 RIP的PCR產(chǎn)物中circ-MALAT1增加約12倍，PAX5增加約40倍。而MALAT1組未發(fā)現(xiàn)顯著差異（圖4D，左圖），表明circMALAT1和PAX5均可與核糖體結(jié)合。接下來，構(gòu)建了兩個(gè)circ-MALAT1突變質(zhì)粒，circMALAT1的640-762位(IRES1)或611-755位(IRES2)分別被非IRES部分取代。裂解轉(zhuǎn)染circ-MALAT1 IRES突變質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞進(jìn)行RIP檢測。circ-MALAT1 IRES2突變樣本的抗RPS6 RIP產(chǎn)物與IgG對(duì)照相比，數(shù)量增加2-3倍，而IRES1突變無差異（圖4D，中圖），表明circ-MALAT1與核糖體結(jié)合需要IRES1和IRES2的共有序列（640-755位）。
為了找出肝癌細(xì)胞中PAX5和circMALAT1之間的相互作用，通過體內(nèi)circMALAT1 pull-down實(shí)驗(yàn)，在純化的circ-MALAT1相關(guān)RNA中通過qRT-PCR檢測PAX5 mRNA。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，circ-MALAT1特異性探針顯著富集circ-MALAT1以及PAX5 mRNA。同時(shí)，在轉(zhuǎn)染circ-MALAT1的Huh7細(xì)胞中，也用生物素標(biāo)記的PAX5 mRNA特異性探針進(jìn)行了體內(nèi)RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，無論是野生型（WT）還是缺失9個(gè)堿基的突變體，這些堿基與PAX5編碼序列互補(bǔ)。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，Huh7樣本中circMALAT1 WT和11 bp MUT過表達(dá)的PAX5 mRNA特異性富集水平相當(dāng)（圖4E，左圖）。然而，突變樣本中circ-MALAT1的富集倍數(shù)（約5倍）遠(yuǎn)低于WT（圖4E，中圖），這表明11個(gè)堿基對(duì)于circ-MALAT1結(jié)合PAX5 mRNA具有重要意義（圖4E，右圖）。然后檢測候選靶蛋白的表達(dá)。Western blot顯示circ-MALAT1過表達(dá)細(xì)胞中PAX5蛋白及其下游蛋白p53下調(diào)（圖4F）。同時(shí)，PAX5和p53也被證實(shí)在CSCs中下調(diào)（圖4G）。然而，當(dāng)突變circMALAT1上的11個(gè)互補(bǔ)堿基或IRES1時(shí)，在circ-MALAT1突變的過表達(dá)細(xì)胞中未觀察到PAX5蛋白的顯著降低（圖4H）。只有轉(zhuǎn)染W(wǎng)T circ-MALAT1的細(xì)胞呈現(xiàn)PAX5蛋白的顯著下調(diào)，但轉(zhuǎn)染circ-MALAT1 IRES2突變體的細(xì)胞表現(xiàn)出PAX5蛋白的輕微下調(diào)（圖4H）。接下來，通過RNA干擾，沉默了Huh7細(xì)胞中的circ-MALAT1或/和PAX5。數(shù)據(jù)顯示，沉默circ-MALAT1可增強(qiáng)PAX5和隨后p53的蛋白水平，而PAX5敲低可抑制該增強(qiáng)?？傊?，上述結(jié)果表明circ-MALAT1通過IRESs競爭性結(jié)合核糖體，從而抑制PAX5翻譯。
圖4. Circ-MALAT1通過與PAX5編碼序列和核糖體結(jié)合，阻礙PAX5翻譯。（A）circ-MALAT1的RNA熒光原位雜交。細(xì)胞核用DAPI染色。針對(duì)circ-MALAT1的綠色染色信號(hào)定位于細(xì)胞質(zhì)。（B）qRT-PCR分析PAX5 mRNA的水平。與對(duì)照(Vector)相比，Circ-MALAT1過表達(dá)(Circ-MALAT1 O/E)導(dǎo)致PAX5 mRNA水平無顯著差異。（C）一個(gè)相互作用模型顯示circ-MALAT1通過11bp堿基配對(duì)（紅色位點(diǎn)）識(shí)別PAX5 mRNA，并通過IRESs（黃色位點(diǎn)）競爭性抑制PAX5翻譯。（D）左圖，使用正常兔IgG或抗RPS6抗體對(duì)circ-MALAT1過表達(dá)的Huh7細(xì)胞制備的RIP裂解物進(jìn)行免疫沉淀。（D）顯示突變IRES(MUT)的circ-MALAT1不能與核糖體結(jié)合。（E）在circ-MALAT1 WT或11 bp MUT過表達(dá)的Huh7細(xì)胞中使用PAX5特異性探針進(jìn)行體內(nèi)RNA pull-down，然后進(jìn)行qRT-PCR檢測PAX5（左圖）和circ-MALAT1（中圖）。（F）western blot檢測PAX5及其下游蛋白p53。（G）western blot分析Hep3B細(xì)胞株CSCs和貼壁細(xì)胞中PAX5和p53。通過腫瘤球?qū)嶒?yàn)富集CSCs。（H）western blot檢測過表達(dá)circ-MALAT1野生型（WT O/E）或突變型（11 bp MUT O/E、IRES1 MUT O/E和IRES2 MUT O/E）或無（Vector）的Huh7細(xì)胞中PAX5。
5 Circ-MALAT1作為miR-6887-3p海綿上調(diào)JAK2。
由于在肝臟CSCs中隨著circ-MALAT1的上調(diào)觀察到JAK2增加，并且已知circRNA作為microRNA海綿上調(diào)靶基因表達(dá)，隨后使用MiRanda程序預(yù)測circ-MALAT1序列上的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析表明，有322個(gè)潛在的miRNA可以被circ-MALAT1結(jié)合。還鑒定了可能靶向JAK2的miRNA。通過重疊兩組miRNA，篩選出121個(gè)預(yù)測的miRNA，因?yàn)樗鼈兣ccirc-MALAT1有結(jié)合位點(diǎn)，并可能靶向JAK2。然后分析miRNA與circ-MALAT1結(jié)合自由能最高的前5位miRNA。隨著circ-MALAT1過表達(dá)，miR-6887-3p表達(dá)大大降低而miR-214-3p、miR-676-5p、miR-503-5p和miR-4773的表達(dá)未表現(xiàn)出明顯變化（圖5A）。進(jìn)一步詳細(xì)分析顯示，circ-MALAT1含有8個(gè)保守的miR-6887-3p種子匹配。體內(nèi)circ-MALAT1 pull-down實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，circ-MALAT1特異性探針可以高效地下拉circ-MALAT1（圖5B，左圖），miR-6887-3p也顯著富集（圖5B，右圖）。這一結(jié)果提示miR-6887-3p是HCC細(xì)胞中circ-MALAT1相關(guān)的miRNA。
接下來評(píng)估JAK2是否是miR-6887-3p的靶標(biāo)。JAK2編碼的mRNA含有一個(gè)3’-非翻譯區(qū)（3’UTR）元件，與miR-6887-3p部分互補(bǔ)，表明miR-6887-3p會(huì)直接靶向該位點(diǎn)。在mRNA和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染miR-6887-3p模擬物或抑制劑的Huh7細(xì)胞中JAK2的表達(dá)。如圖5C所示，用miR-6887-3p模擬物處理后，JAK2 mRNA沒有受到顯著影響（上圖），但JAK2蛋白顯著下降（下圖）。相反，miR-6887-3p抑制劑處理后JAK2表達(dá)表現(xiàn)出相反的趨勢（圖5D）。這一發(fā)現(xiàn)表明miR-6887-3p可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制JAK2表達(dá)。為了證實(shí)這一發(fā)現(xiàn)，將含有野生型和突變型假定miR-6887-3p結(jié)合位點(diǎn)的JAK2 mRNA的3’-UTR插入熒光素酶報(bào)告載體中，分別生成pMIR-JAK2-3'UTR-WT和pMIR-JAK2-3'UTR-MUT。pMIR-JAK2-3'UTRWT的熒光素酶活性可以被miR-6887-3p模擬物有效抑制（圖5E，上圖），并被其抑制劑增強(qiáng)（圖5E，下圖），而當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，沒有觀察到明顯的變化。然后Western blot證實(shí)在Hep3B細(xì)胞系中過表達(dá)circ-MALAT1后JAK2/STAT3信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白分子的表達(dá)發(fā)生變化。過表達(dá)circMALAT1可減弱miR-6887-3p對(duì)JAK2的抑制作用，從而增加JAK2的總蛋白水平，增強(qiáng)其磷酸化水平（圖5F）。進(jìn)一步促進(jìn)STAT3的磷酸化和活化（圖5E）。然而，STAT3的總蛋白水平無顯著變化（圖5F）。此外，還證實(shí)JAK2/STAT3信號(hào)通路中的3個(gè)關(guān)鍵蛋白分子JAK2、磷酸化JAK（2p-JAK2）和磷酸化STAT3（p-STAT3）在CSCs中上調(diào)（圖5G）。
圖5 Circ-MALAT1作為miR-6887-3p海綿上調(diào)JAK2。（A）通過qRT-PCR分析過表達(dá)circ-MALAT19（circ-MALAT1 O/E）或空載體（vector）Huh7細(xì)胞中結(jié)合自由能最高的前5位miRNA。（B）在過表達(dá)circ-MALAT1的Huh7細(xì)胞中使用circ-MALAT1特異性探針進(jìn)行體內(nèi)circ-MALAT1 pull-down，然后進(jìn)行qRT-PCR檢測circ-MALAT1（左圖）和miR-6887-3p（右圖）。（C）用miR-6887-3p mimic或其亂序版本處理后，qRT-PCR檢測miR6887-3p水平和mRNA處JAK2表達(dá)（上圖），western blot檢測蛋白水平JAK2表達(dá)（下圖）。（D）用miR-6887-3p抑制劑或其亂序版本（對(duì)照抑制劑）處理后，qRT-PCR檢測miR-6887-3p和JAK2 mRNA的水平（上圖），western blot檢測蛋白水平的JAK2表達(dá)（下圖）。使用U6和GAPDH作為對(duì)照引物。（E）當(dāng)細(xì)胞與miR-6887-3p mimic（上圖）或miR-6887-3p inhibitor（下圖）共轉(zhuǎn)染時(shí)，檢測pMIR-JAK2-3’UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶活性。（F）通過western blot分析circ-MALAT1過表達(dá)（circ-MALAT1 O/E）或空載體（vector）細(xì)胞中JAK2/STAT3通路的關(guān)鍵分子。（G）western blot分析Hep3B細(xì)胞系CSCs和貼壁細(xì)胞中JAK2/STAT3信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白分子。
6 Circ-MALAT1在體內(nèi)吸收miR-6887-3p上調(diào)JAK2。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-6887-3p在體內(nèi)的特異性，分析了用miR-6887-3p模擬物或抑制劑處理后異種移植腫瘤中JAK2的表達(dá)。用miRNA模擬物處理后，JAK2 mRNA和circ-MALAT1沒有受到顯著影響（圖6A，上圖），但用miR-6887-3p模擬物處理后，JAK2蛋白顯著下降（圖6A，下圖）。相反，用miR-6887-3p抑制劑處理的腫瘤中JAK2表達(dá)表現(xiàn)出相反的趨勢（圖6B）。此外，由于MALAT1減弱了miR-6887-3p對(duì)JAK2蛋白的抑制作用（圖6C），體內(nèi)p-JAK2增強(qiáng)（圖6D）?？傊?，上調(diào)CSCs中的circ-MALAT1可以吸收miR-6887-3p，從而增強(qiáng)JAK2/STAT3通路活性，用于肝細(xì)胞CSCs的自我更新。
圖6 Circ-MALAT1在體內(nèi)吸收miR-6887-3p上調(diào)JAK2。（A）用miR-6887-3p mimic、miR-512-5p mimic或其亂序版本（control mimic）處理后，qRT-PCR法（上圖）檢測移植瘤的circ-MALAT1和JAK2 mRNA，western blot法（下圖）檢測蛋白水平的JAK2表達(dá)。（B）經(jīng)miR-6887-3p抑制劑、miR-512-5p抑制劑或其亂序版本（對(duì)照抑制劑）處理后，qRT-PCR檢測移植瘤的circ-MALAT1和JAK2 mRNA（上圖），western blot檢測蛋白水平JAK2表達(dá)（下圖）。（C）在circ-MALAT1過表達(dá)(circ-MALAT1 O/E)或空載體（vector）Huh7細(xì)胞產(chǎn)生的異種移植腫瘤中分析miR-6887-3p表達(dá)。（D）在circ-MALAT1過表達(dá)（circ-MALAT1 O/E）或空載體（vector）Huh7細(xì)胞生成的異種移植腫瘤中測定p-JAK2。
討論
本研究結(jié)果顯示了circRNA的一種新的雙面調(diào)控途徑（圖7）。一方面，circ-MALAT1通過miR-6887-3p上調(diào)癌基因JAK2，增加磷酸化的JAK2，增強(qiáng)JAK2/STAT3信號(hào)，促進(jìn)肝臟CSCs自我更新。另一方面，重要的是，本研究發(fā)現(xiàn)了一種新的mRNA制動(dòng)機(jī)制，其中circRNA分子作為剎車，通過同時(shí)結(jié)合核糖體和PAX5 mRNA直接抑制PAX5 mRNA翻譯。circMALAT1不僅結(jié)合核糖體，還結(jié)合PAX5 mRNA的編碼序列，形成特異性的三元復(fù)合物。三元復(fù)合物使circ-MALAT1像剎車一樣鑲嵌在PAX5編碼序列和核糖體之間，直接阻礙PAX5 mRNA的翻譯，影響PAX5相關(guān)的細(xì)胞功能。研究人員認(rèn)為mRNA剎車，通過形成前所未有的三元復(fù)合物ribosomecirc-MALAT1-PAX5 mRNA，是circRNA在生理和病理?xiàng)l件下的一種新型調(diào)控模式。
圖7 Circ-MALAT1作為mRNA制動(dòng)器和microRNA海綿，促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制示意圖。
評(píng)論
本研究通過環(huán)狀RNA測序(circRNA-seq)數(shù)據(jù)，比較了HCC細(xì)胞系和HCC原代細(xì)胞的匹配CSCs和貼壁細(xì)胞中的環(huán)狀RNA表達(dá)，并檢測了一些在CSCs中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，發(fā)現(xiàn)circ-MALAT1通過帶有兩個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)，與抑癌基因PAX5的核糖體和mRNA形成復(fù)合物。由此產(chǎn)生的的三元復(fù)合物延緩PAX5 mRNA翻譯，并最終有助于CSCs的維持。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Circ-MALAT1通過作為miR-6887-3p海綿增強(qiáng)JAK2表達(dá)，激活JAK2/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)CSC自我更新。
本研究發(fā)現(xiàn)了非編碼RNA負(fù)調(diào)控編碼基因翻譯的一種新模式，揭示了環(huán)狀RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的雙面模式，最終維持細(xì)胞的特定狀態(tài)。進(jìn)一步深入研究現(xiàn)的環(huán)狀RNA的mRNA制動(dòng)機(jī)制，有望為揭示環(huán)狀RNA在調(diào)節(jié)生命活動(dòng)中的作用揭開新篇章。
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