編譯：思越，編輯：景行、江舜堯。
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在歐洲人群過去的幾千年，2q21.3的優(yōu)勢進(jìn)化在人體代謝功能中起到關(guān)鍵作用，這種長單倍型有助于他們消化牛奶中的乳糖，并以此囤積脂肪度過饑荒，以獲得更大的生存優(yōu)勢。但在現(xiàn)代生活中，2q21.3基因座也與人類肥胖和II型糖尿病相關(guān)。在本篇文章中，作者對其2q21.3單倍型進(jìn)行了分析，這段序列在進(jìn)化的過程中高度活躍，且和乳糖酶持續(xù)現(xiàn)象關(guān)系緊密。此外，作者鑒定到2q21.3基因座上的MicroRNA——miR-128-1 受到正選擇并且是哺乳動(dòng)物關(guān)鍵的能量和代謝調(diào)節(jié)因子，在高脂飲食處理或瘦素編碼基因突變所誘導(dǎo)小鼠肥胖模型中，抑制 miR-128-1 表達(dá)會(huì)增加能量消耗，改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，并顯著提高糖耐受性及胰島素響應(yīng)。
論文ID
原名：A MicroRNA Linking Human Positive Selection and Metabolic Disorders
譯名：MicroRNA與人類進(jìn)化正向選擇和代謝障礙相關(guān)
期刊：Cell
IF：38.637
發(fā)表時(shí)間：2020年10月
通訊作者：Anders M. N??r
通訊作者單位：麻省總醫(yī)院癌癥中心
DOI號(hào)：10.1016/j.cell.2020.09.017
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
結(jié)果
作者首先研究了歐洲人群體中2q21.3基因座的單倍型結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在R3HDM1基因?yàn)橹行牡拈L單倍型上存在強(qiáng)烈的突變信號(hào)（圖1A），其中部分點(diǎn)突變靠近此前發(fā)現(xiàn)的，與脂質(zhì)代謝高度關(guān)聯(lián)的 miRNA 序列——miR-128-1，暗示2q21.3與代謝調(diào)控可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。與此同時(shí)，在人工選擇和自然選擇的情況中，對牛的選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)R3HDM1與提高飼料效率和增加肌間脂肪有關(guān)，對狗的選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)R3HDM1與體重增加有關(guān)，且都在進(jìn)化過程中受到了強(qiáng)烈的正選擇效應(yīng)（圖1B）。
由于觀察到的成年牛和狗已經(jīng)斷奶，故乳糖酶持久（LP）現(xiàn)象不能解釋這些突變在牛和狗類導(dǎo)致的體重差異。接著，作者利用英國生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全表型關(guān)聯(lián)分析 (PheWAS)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1C），長單倍型2q21.3變異與體脂表型性狀有關(guān)，包括整體體脂、軀干脂肪和腿部脂肪百分比。
通過對古代歐洲不同群體的遺傳信息分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)歐洲人群體的2q21.3基因座都受到了正選擇，該正選擇事件起始于約4000年前的草原祖先，說明該單倍型是作為一個(gè)整體進(jìn)行選擇的（圖1D），并且與現(xiàn)代歐洲人中觀察到的跨基因座的等位基因頻率的變化一致。
圖1. 哺乳動(dòng)物2q21.3基因座的選擇 （A）2q21.3基因座上存在強(qiáng)烈的正選擇信號(hào)；（B）2q21.3基因座單倍型突變在歐洲人群、牛、狗進(jìn)化過程中受到正選擇（C）rs1438307位點(diǎn)的全表型相關(guān)性分析（phewas）分析，顯示該基因座變異水平與人多種體-脂相關(guān)表型緊密關(guān)聯(lián)。（D）對不同古代歐洲人種的DNA分析，對2q21.3基因座的進(jìn)化正選擇起始于約4000年前的草原祖先。
為了探索哪些細(xì)胞類型最有可能與2q21.3基因座的代謝特征相關(guān)，作者對 127 種人類細(xì)胞類型的染色質(zhì)狀態(tài)圖譜進(jìn)行了分析（圖2A）,發(fā)現(xiàn)2q21.3基因座與血液，嬰兒大腦以及包括脂肪細(xì)胞在內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞有關(guān)。通過分析淋巴母細(xì)胞中的染色質(zhì)構(gòu)象數(shù)據(jù)（圖2B），發(fā)現(xiàn)2q21.3中存在一個(gè)包含 R3HDM，miR-128-1 與 ZRANB3 的拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域(TAD)，并發(fā)現(xiàn)突變 rs1438307位于該TAD的邊緣，且該TAD位于一個(gè)更大的含有RAB3GAP1的結(jié)構(gòu)域中（圖2C），暗示陽性選擇單倍型可能與染色質(zhì)可及性和整個(gè)基因座表達(dá)的改變有關(guān)。
接著，作者檢測了染色質(zhì)邊界因子CTCF與單倍型結(jié)合的差異，發(fā)現(xiàn)CTCF確實(shí)優(yōu)先結(jié)合rs1438307為T的等位基因，具有更高的染色質(zhì)開放性（圖2D），且T等位基因還與R3HDM1以及UBXN4、ZRANB3和RAB3GAP1的表達(dá)增加有關(guān)。
此外，作者通過分析GDSC數(shù)據(jù)庫中984株細(xì)胞系的表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn) miR-128-1宿主基因 R3HDM1的表達(dá)與 MCM6基因的表達(dá)密切相關(guān)（圖2E），并通過CCLE數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了驗(yàn)證（圖2F），說明rs1438307與與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和可及性相關(guān)，通過表觀遺傳調(diào)控改變整個(gè)基因座的協(xié)同表達(dá)。此外，后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明在miR-128-1啟動(dòng)子上，rs1438307的T等位基因具有更高的DNase I可及性，且EQTL分析發(fā)現(xiàn)miR-128-1的表達(dá)在不同2q21.3 單倍型的歐洲人的白色脂肪組織（WAT）中出現(xiàn)了顯著差別。
綜上，位于2q21.3的歐洲長單倍型與整個(gè)基因位點(diǎn)染色質(zhì)可及性增加相關(guān)，導(dǎo)致miR-128-1和該基因位點(diǎn)共表達(dá)的基因協(xié)同上調(diào)，且 miR-128-1 的表達(dá)可能在能量消耗與代謝調(diào)節(jié)中起到了關(guān)鍵作用。
圖2. 人類2q21.3調(diào)控回路 （A）miR-128-1周圍區(qū)域127種細(xì)胞的染色質(zhì)狀態(tài)；（B）Hi-C分析顯示2q21.3基因座區(qū)域染色質(zhì)開放，其邊界與rs1438307重合；（C）包含RAB3GAP1、DARS和CXCR4在內(nèi)的更大的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域；（D）含有rs1438307變異位點(diǎn)的ENCODE細(xì)胞系中，目標(biāo)CTCF峰的強(qiáng)度和R3HDM1基因的表達(dá)顯著增加。（E）GDSC的CellMinerCDB數(shù)據(jù)分析顯示，跨越該位點(diǎn)的R3HDM1和MCM6的基因表達(dá)高度相關(guān)。（F）miR-128-1的表達(dá)與宿主基因R3HDM1的表達(dá)高度相關(guān)。
2 抗miR寡核苷酸促進(jìn)能量消耗并減少飲食相關(guān)肥胖發(fā)生
為了探討 miR-128-1是否在調(diào)節(jié)能量消耗和代謝控制中發(fā)揮作用，作者使用抗 miR-128-1 寡核苷酸探究miR-128-1在高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的雄性小鼠（飲食誘導(dǎo)肥胖(DIO)模型）中的抑制作用。通過對DIO小鼠進(jìn)行16周的寡核苷酸注射后，miR-128-1在代謝組織中表達(dá)顯著降低（圖3A和圖3B）。通過對核磁共振進(jìn)行的體成分研究顯示，注射后的小鼠脂肪儲(chǔ)存量顯著減少（圖3C），內(nèi)臟(附睪)和皮下(腹股溝)脂肪墊明顯變小，且肝臟脂質(zhì)堆積減少（圖3D）。此外，對生熱和調(diào)節(jié)能量消耗方面起著關(guān)鍵作用的小鼠棕色脂肪組織（BAT）中，抗miR-128-1治療增加了棕色脂肪的生成（圖3D）。
接下來，作者評估了抗mir-128-1治療在棕色脂肪組織(BAT)、白色脂肪組織(WAT)、肝和骨骼肌等代謝組織中的表型效應(yīng)。在BAT中，組織學(xué)分析顯示，脂肪的積聚明顯減少，并且使用識(shí)別BAT標(biāo)志的抗體，解偶聯(lián)蛋白1（Ucp1）顯著增加了染色（圖3E），且有關(guān)促進(jìn)BAT細(xì)胞命運(yùn)和刺激線粒體生物合成和脂肪酸β氧化的相關(guān)基因Prdm16，Ppargc1a 和 Ppara等靶點(diǎn)的 mRNA 水平增加（圖3F）。在WAT中，抗miR-128-1治療使DIO小鼠的脂肪細(xì)胞變小，并減少了附睪WAT中脂肪細(xì)胞周圍巨噬細(xì)胞的聚集（圖3G），且而編碼炎性細(xì)胞因子的基因 Tnfa，Il-1b，Il-6和 Mcp1顯著下調(diào)（圖3H）。在肝臟中，抗miR-128-1治療可以顯著減少DIO小鼠的肝臟脂質(zhì)堆積和炎癥（圖3I）。肝臟脂肪含量的顯著減少與 Srebp1轉(zhuǎn)錄因子下降有關(guān)，Srebp1的靶基因Acc1和Fasn也發(fā)生了協(xié)同下降（圖3J），此外與脂肪生成和脂肪儲(chǔ)存相關(guān)的基因PPARG和FABP4的表達(dá)也降低。在骨骼肌中，抗mir-128-處理的DIO小鼠有關(guān)細(xì)胞代謝回路 pparα，pgc-1α，Ampkα2，Ucp3等基因也都發(fā)生了上調(diào)（圖3K-圖3M）。此外，作者也檢測了這些肥胖小鼠體內(nèi)的糖代謝功能。在抗 mir-128-1治療后，肥胖小鼠體內(nèi)的糖代謝紊亂得到了極大的改善。在胰島素的刺激下，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血糖控制的更加穩(wěn)定，其骨骼肌與肝臟對胰島素也更加敏感（圖O-P）。
圖3.對高脂飲食的小鼠皮下注射anti-miR-128-1可以緩解飲食導(dǎo)致的肥胖、減少內(nèi)臟和皮下脂肪的增殖和炎癥反應(yīng)、減輕肝脂肪變和炎癥，增加全身能量消耗，改善血糖穩(wěn)態(tài)。（A）18周時(shí)注射anti-miR-128-1及對照組DIO小鼠。（B-D）注射組和對照組的體重、體成分和DIO小鼠組織圖像。（E,G,I）BAT、EPI-Wat和肝臟組織學(xué)數(shù)據(jù)。（F,H,J）BAT、WAT炎癥、肝脂肪變性相關(guān)基因的表達(dá)。（K-M）與葡萄糖穩(wěn)態(tài)和能量消耗相關(guān)的肌肉中標(biāo)記基因和蛋白表達(dá)。（N）注射組和對照組的全身能量消耗差異。（O-P）注射組和對照組葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)。
3 miR-128-1是糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
肝臟和骨骼肌中的肥胖和異位脂肪沉積常常與胰島素抵抗和葡萄糖控制不良有關(guān)，并且是II型糖尿病（T2D）發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素。為了進(jìn)一步確定 miR-128-1在肥胖相關(guān)的葡萄糖異常中的作用，作者對經(jīng)過抗miR-128-1和對照抗mir治療的DIO小鼠進(jìn)行了高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)，在抗miR-128-1小鼠中，除了體重的降低和脂肪的減少（圖4A-B），在胰島素刺激的全身葡萄糖代謝中表現(xiàn)出顯著的改善（圖4C-E），以及在骨骼肌中2-脫氧葡萄糖攝取的增加(圖4F)和肝臟葡萄糖的生成抑制(圖4G)。此外，抗miR-128-1治療還表現(xiàn)出Wat胰島素敏感性的增加和包括WAT對2-脫氧葡萄糖的攝取增加(圖4F)以及增強(qiáng)WAT對非酯化脂肪酸（NEFA）釋放的抑制作用（圖4H），證明miR-128-1在調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)的代謝回路中的關(guān)鍵作用。因此，食物誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型證明了miR-128-1能夠改善肥胖小鼠的代謝狀態(tài)，緩解胰島素抵抗和炎癥等病理反應(yīng)。
圖4.抑制了miR-128-1的小鼠在高脂飲食狀態(tài)下肥胖程度減輕，肝臟、骨骼肌及脂肪組織的胰島素敏感性更高。（A-B）抑制組小鼠的體重、體脂百分比。（C-E）高胰島素-正血糖鉗夾期間的血糖濃度變化，以及維持正常血糖所需的葡萄糖輸注速率、穩(wěn)態(tài)葡萄糖輸注速率。（F）骨骼肌和白色脂肪組織的葡萄糖攝取。（G-H）鉗夾期間內(nèi)源性葡萄糖和血漿NEFA的生成抑制。
4 敲除miR-128-1證實(shí)了miR-128-1的“節(jié)儉”特性
為了證實(shí) miR-128-1在控制體內(nèi)能量消耗方面的作用，作者構(gòu)建了miR-128-1敲除（KO）的突變體小鼠。與野生型相比，高脂飲食飼喂下miR-128-1 KO小鼠的體重增加程度及WAT體積明顯小于野生型（圖5A-B），且miR-128-1 KO 小鼠能量消耗明顯增加，但對活動(dòng)沒有明顯的影響(圖5C 和5D)，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐寒功能（圖5E），且BAT細(xì)胞內(nèi)脂肪顯著減少（圖5F）并具有更大的線粒體耗氧率和能量消耗（圖5G）。此外，與寡核苷酸進(jìn)行敲除的DIO小鼠類似，KO小鼠也表現(xiàn)出顯著的葡萄糖穩(wěn)態(tài)改善和對胰島素的反應(yīng)增加(圖5H和5I)。因此，miR-128-1是一種“節(jié)儉型”miRNA，能通過降低能量消耗水平及促進(jìn)脂肪儲(chǔ)存調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的系統(tǒng)性代謝。
圖5.敲除miR-28-1使高脂飲食狀態(tài)小鼠增加全身能量消耗，改善血糖穩(wěn)態(tài)。（A-D）對照組和敲除小鼠的體重、體成分變化、全身能量消耗和活動(dòng)差異。（E）冷暴露下兩組小鼠的直腸溫度變化。（F）Ucp1免疫組化。（G）棕色脂肪細(xì)胞能量消耗差異。（H-I）葡萄糖耐量和胰島素耐量試驗(yàn)
5 miR-128-1調(diào)節(jié)白色脂肪的分化和功能
接著，作者研究了miR-128-1調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的分子機(jī)制。在WAT細(xì)胞分化過程中，過量的miR-128-1處理會(huì)抑制來源于WAT的初級(jí)脂肪細(xì)胞的分化水平，導(dǎo)致脂肪生成減少，脂肪細(xì)胞數(shù)量減少，并降低WAT分化過程中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子PPARG，CEBPA，F(xiàn)ABP4，PPARGC1A和PPARA，以及脂聯(lián)素脂聯(lián)素（ADIPOQ）和瘦素（LEP）的表達(dá)水平(圖6A和6B)。但是，抑制miR-128-1表達(dá)能夠誘導(dǎo)初級(jí)脂肪細(xì)胞的分化，并增加成熟Wat相關(guān)基因的表達(dá)(圖6C和6D)，miR-128-1能夠直接或間接調(diào)節(jié)瘦素和脂連蛋白的表達(dá)（圖6E和圖6F）。此外，改變miR-128-1水平對AMPKα2、pGC-1α、SIRT1、PPARα、PPARγ、INSR和IRS1等靶蛋白的水平也會(huì)發(fā)生改變(圖6G)， 并能抑制WAT來源的脂肪細(xì)胞中的脂肪酸氧化水平（圖6H和圖6I）。
圖6.調(diào)控人前成脂細(xì)胞miR-128-1水平可改變脂肪細(xì)胞分化、瘦素和脂聯(lián)素分泌以及脂肪氧化代謝。（A-D）過表達(dá)前miR-128-1抑制人脂肪細(xì)胞分化，下調(diào)脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，抗miR-128-1促進(jìn)人脂肪細(xì)胞原代分化，上調(diào)脂肪細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)。（E-F）經(jīng)miR-128-1前體和抗miR-128-1處理后，人原代脂肪細(xì)胞瘦素和脂聯(lián)素分泌水平變化。（G）原代人脂肪細(xì)胞中脂肪細(xì)胞基因的水平。（H-I）過表達(dá)miR-128-1或敲除miR-128-1對原代人類脂肪細(xì)胞FAO的影響。
6 miR-128-1抑制棕色脂肪細(xì)胞的命運(yùn)和能量消耗
考慮到抗miR-128-1治療的中觀察到的對BAT分化和能量消耗的影響，作者評估了miR-128-1在調(diào)節(jié)棕色脂肪細(xì)胞體外分化中的分子機(jī)制和功能。在BAT細(xì)胞的分化過程中，發(fā)現(xiàn)miR-128-1的缺失導(dǎo)致分化為成熟棕色脂肪細(xì)胞的能力顯著增強(qiáng)(圖7A)，并通過海馬分析結(jié)果顯示miR-128-1基因缺失小鼠的棕色脂肪細(xì)胞能量消耗增加(圖7B)。并發(fā)現(xiàn)，棕色脂肪標(biāo)志基因Prdm16、Ucp1，以及參與脂肪細(xì)胞命運(yùn)決定和調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和能量消耗表達(dá)程序相關(guān)基因PPARG、Ppara、Ppargc1a)的表達(dá)增加（圖7C-G）。
因此，miR-128-1能通過細(xì)胞自主性方式抑制前體細(xì)胞分化產(chǎn)生BAT細(xì)胞的能力，并抑制BAT細(xì)胞的能量代謝。接著通過加入棕色脂肪誘導(dǎo)劑DBcAMP對比發(fā)現(xiàn)，pre-miR-128-1 的加入也能在棕色脂肪細(xì)胞中有效的影響其目標(biāo)基因 Pparg, Ppara 和 Ppargc1a 的表達(dá)，而這些基因直接決定能量消耗的多少（圖7H-J）。此外，將抗miR-128-1基因?qū)氤墒旆只男∈笞厣炯?xì)胞，可顯著抑制這些基因的表達(dá)(圖7K-7M)。細(xì)胞譜系追蹤研究表明，棕色脂肪細(xì)胞可以來自Myf5陽性的骨骼肌前體譜系。體外研究還表明，小鼠C2C12肌肉前體細(xì)胞系可以分化為棕色脂肪細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)，抗miR-128-1處理的C2C12細(xì)胞顯著促進(jìn)了棕色系的融合和向成熟棕色脂肪細(xì)胞的分化，并促進(jìn)了如Prdm16，Ucp1，CIDA，Elov13，Ppargc1a，Ppara等棕色脂肪標(biāo)志基因的表達(dá)（圖7N-R）。此外，抑制miR-128-1的表達(dá)會(huì)促進(jìn)C2C12細(xì)胞的脂肪酸氧化及能量消耗，并提高C2C12細(xì)胞分化產(chǎn)生BAT細(xì)胞的能力（圖7S-T）。因此，miR-128-1能通過細(xì)胞自主性方式抑制前體細(xì)胞分化產(chǎn)生BAT細(xì)胞的能力，并抑制BAT細(xì)胞的能量代謝。
結(jié)論
本研究通過將基因組水平上的分子進(jìn)化分析與代謝分析相結(jié)合，并利用多種小鼠代謝異常模型及突變體模型，將2q21.3基因座的優(yōu)勢進(jìn)化與異常代謝聯(lián)系起來，并揭示了該基因座中的miR-128-1在哺乳動(dòng)物能量消耗與儲(chǔ)存中的關(guān)鍵作用，細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)直接證明了作為 miR-128-1 在能量代謝，脂質(zhì)代謝以及糖代謝中的關(guān)鍵作用。該研究也在分子層面揭示了 miR-128-1 是如何通過調(diào)控 BAT 的細(xì)胞命運(yùn)來改變這些表型。從進(jìn)化角度上說，miR-128-1表達(dá)水平的改變在古代有助于囤積脂肪度過饑荒，以獲得更大的生存優(yōu)勢，但是在物質(zhì)水平豐富的現(xiàn)代生活中，又會(huì)造成人類代謝適應(yīng)性下降，甚至導(dǎo)致肥胖和2型糖尿病等代謝疾病，并可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。
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