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編譯：秦時(shí)明月，編輯：景行、江舜堯。

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原名：Marchantia TCP transcription factor activity correlates with three-dimensional chromatin structure

譯名：地錢草的TCP轉(zhuǎn)錄因子活性與三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)

期刊：Nature Plants

IF：13.256

發(fā)表時(shí)間：2020年9月

通訊作者：劉昶

通訊作者單位：德國(guó)圖賓根大學(xué)植物分子生物學(xué)中心

DOI號(hào)：10.1038/ s41477-020-00766-0

研究人員從兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中生成了地錢草的高分辨率Hi-C圖譜。在最近的一項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)在染色體水平上，地錢屬的性別和常染色體在線性基因組結(jié)構(gòu)、表觀基因組圖譜和三維染色體組織方面具有顯著的特征。因此，這項(xiàng)工作中的所有分析都集中在常染色體上。研究人員發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分地錢草基因組清楚地顯示了TADs (圖1A)。通過(guò)對(duì)所有常染色體的肉眼觀察表明，地錢草 TADs并不是直接相鄰的，這是動(dòng)物TADs 的一個(gè)特征。相反，與高等植物相似，TAD結(jié)構(gòu)之間也有非TAD區(qū)域。研究人員應(yīng)用了先前建立的“箭頭”方法來(lái)掃描Hi-C圖，并注釋了4013個(gè)TAD。它們散布在所有的染色體上，共同覆蓋了基因組的40%。通過(guò)檢查這些TADs的線性基因組和表觀基因組特征，研究人員發(fā)現(xiàn)它們與其鄰近的染色質(zhì)區(qū)域明顯不同。一般來(lái)說(shuō)，異色和等色標(biāo)記分別在TADs的內(nèi)部和側(cè)翼區(qū)域高度富集(圖1B)。地錢草 TADs和TAD邊界染色質(zhì)狀態(tài)的這些特征與許多其他植物基因組中注釋的TADs相似，研究人員也可以檢測(cè)到與擬南芥中的“TAD內(nèi)部類似”和“TAD邊界類似”區(qū)域的相似性。此外，地錢草 TADs缺乏基因；而它們的邊界優(yōu)先與基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)(TTS)重疊(圖1C，D)。因此，TAD小體富含各種類型的重復(fù)序列，并顯示出高度的DNA甲基化(圖1E)。綜上所述，地錢草 TADs主要是散布在染色體上的異染色質(zhì)和/或較長(zhǎng)的基因間隔區(qū)，它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)以自組織結(jié)構(gòu)模塊的形式出現(xiàn)。

盡管從它們的平均分布來(lái)看，它們是異質(zhì)的，但地錢草 TADs并不是一個(gè)同質(zhì)的種群。通過(guò)觀察單個(gè)TAD中的平均甲基化比率，研究人員發(fā)現(xiàn)它們至少可以分為兩類，其中成員始終高度甲基化(MCG比率≈0.8)或無(wú)甲基化(MCG比率≈0)(圖1F)。為了更深入地了解TADs的這些亞類，研究人員隨意將它們注釋為“MCG-poor”(MCG比率低于0.2)、“MCG-rich”(MCG比率高于0.6)和“MCG-Medium”(MCG比率在0.2和0.6之間)(圖1F)。正如預(yù)期的那樣，除了被等色標(biāo)記外，富含MCG的TADs還被密集的異染色質(zhì)標(biāo)記(例如，H3K9me1和H3K27me1)。通過(guò)計(jì)算相互作用衰減指數(shù)，描述染色質(zhì)相互作用強(qiáng)度隨著基因組距離的增加而下降的速度，研究人員發(fā)現(xiàn)富含MCG的異染色質(zhì)TADs比其他兩種類型的染色質(zhì)組織更密集(圖1G)。有趣的是，MCG貧乏的TADs顯示出活性表觀遺傳標(biāo)記的適度耗盡和H3K27me3的富集，這表明它們?cè)谵D(zhuǎn)錄方面總體上不是高度活躍的。與全基因組基因表達(dá)譜相比，位于富含MCG的TADs中的基因表現(xiàn)出較低的表達(dá)水平。值得注意的是，富含MCG和缺乏MCG的TADs在其邊界都顯示了可接近的染色質(zhì)的富集，這意味著地錢草 TAD邊界的形成與邊界區(qū)域和未知的染色質(zhì)相互作用因子之間的相互作用有關(guān)。由于地錢草 TADs不是同源的，研究人員根據(jù)最近公布的描述各種地錢草組蛋白標(biāo)記的數(shù)據(jù)集對(duì)它們進(jìn)行分類。使用這種方法，研究人員將TADs分為8個(gè)簇，其中簇4(富含H3K9ac和H2A.Z)和簇5、6(富含H3K9me1和H3K27me1)總共包括超過(guò)60%的注釋TAD(圖1H)。這三個(gè)簇占DNA甲基化水平注釋的TAD組的大部分。綜上所述，地錢草 TADs是具有不同表觀遺傳學(xué)特征的單個(gè)染色質(zhì)區(qū)域的混合群體。

接下來(lái)，研究人員研究了TAD布局是否與基因共表達(dá)有關(guān)，因?yàn)槿绻粋€(gè)基因?qū)ξ挥诖龠M(jìn)啟動(dòng)子接觸的同一個(gè)TAD中，預(yù)計(jì)會(huì)發(fā)現(xiàn)更頻繁的基因協(xié)同調(diào)節(jié)。在這方面，研究人員通過(guò)整合不同發(fā)育階段的不同地錢草組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)產(chǎn)生共表達(dá)矩陣。由于物理連鎖和順式元件的共享，在線性基因組中相互毗鄰的基因(分隔不到5千Kb)顯示出較高水平的正相關(guān)表達(dá)。除此之外，研究人員發(fā)現(xiàn)TADs含有比預(yù)期更多的共表達(dá)基因?qū)?，這表明地錢草 TAD的劃分是共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制的一部分。

圖1. 地錢草常染色體的相關(guān)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域。A 2號(hào)染色體600kb區(qū)域的Hi-C圖譜快照。B 平均表觀遺傳特征在地錢草TADs上的分布。C TADs周圍的蛋白質(zhì)編碼基因注釋。D、TSS和TTS在TAD邊界附近的分布。E CG、CHG和CHH甲基化在TADs中的分布。F TADs群體CG DNA甲基化水平分布。G 用相互作用衰減指數(shù)比較不同類型TADs的染色質(zhì)致密性。H 根據(jù)表觀遺傳聚類(根據(jù)組蛋白標(biāo)記)和DNA甲基化對(duì)TADs進(jìn)行分類。

2   TCP1蛋白在許多TAD邊界富集，但對(duì)于TAD的形成是不必要的

在動(dòng)物中，CTCF絕緣蛋白與粘附素一起，通過(guò)與TAD邊界的染色質(zhì)相互作用，促進(jìn)TAD的形成。以前，研究人員發(fā)現(xiàn)水稻基因組中的TAD邊界富含植物特異性I類TCP轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的基序。地錢草基因組編碼兩個(gè)TCP基因TCP1和TCP2，分別屬于I類和II類分支。由于每個(gè)地錢草 TCP與同一支系中的原始成員相比有一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域，研究人員預(yù)計(jì)它們應(yīng)該能識(shí)別在高等植物中發(fā)現(xiàn)的已知共識(shí)DNA序列。因此，假設(shè)植物TCP蛋白參與TAD邊界的形成，研究人員檢查了TCP結(jié)合基序是如何跨越地錢草 TAD邊界分布的?；蛳嗨菩远攘糠治霰砻?，TCP1識(shí)別的序列在TAD邊界區(qū)域明顯富集；而TCP2識(shí)別的序列略有富集。此外，表達(dá)分析表明TCP1在菌體中組成性轉(zhuǎn)錄，而TCP2不能被檢測(cè)到。這些數(shù)據(jù)表明TCP1是TADs的潛在調(diào)節(jié)因子，這促使研究人員合成TCP1抗體來(lái)進(jìn)行Chip-Seq實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)體內(nèi)TCP1-染色質(zhì)的相互作用。

TCP1與地錢草基因組有廣泛的相互作用?？偣?，在常染色體中大約有11,600個(gè)區(qū)域被鑒定為TCP1峰，它們總共覆蓋了大約11.8Mb(~5%)的基因組。與TCP1結(jié)合的染色質(zhì)被H2A.Z高度富集，但異染色質(zhì)減少，表明該轉(zhuǎn)錄因子不與異染色質(zhì)相互作用。研究人員進(jìn)行了從頭測(cè)序分析，以揭示富集在TCP1峰中的基序。正如預(yù)期的那樣，在所有確定的基序中，與高等植物中I類TCP蛋白識(shí)別的典型序列基序相似的一個(gè)序列在TCP1峰區(qū)的中心顯示出最強(qiáng)勁的富集。通過(guò)檢查TADs處的TCP1峰分布，研究人員發(fā)現(xiàn)TCP1在TAD邊界處富集(圖2A)。在所有4013個(gè)已鑒定的TADs 中，1164個(gè)(29%)TCP1峰在附近(1kb以內(nèi))與其重疊；499個(gè)(12%)TCP1具有與TCP1相關(guān)的兩個(gè)邊界。此外，與TAD邊界相關(guān)的TCP1 Chip-Seq峰比預(yù)期的多(圖2B)。這些觀察表明，地錢草 TADs和TCP1的邊界有明顯的重疊。對(duì)于單個(gè)基因，TCP1可以與高表達(dá)和低表達(dá)的基因相互作用，暗示TCP1和基因表達(dá)之間的復(fù)雜關(guān)聯(lián)(圖2C)。有趣的是，對(duì)于中度到高表達(dá)的TCP1靶基因，TCP1主要與它們的TSS和/或TTS結(jié)合；而對(duì)于那些低表達(dá)或沉默的基因，TCP1往往通過(guò)它們的基因體相互作用(圖2C)，這意味著TCP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式不同。

接下來(lái)，研究人員使用CRISPR-Cas9基因編輯來(lái)評(píng)估TCP1缺失對(duì)TAD結(jié)構(gòu)的影響。與最近的一項(xiàng)研究一致，研究人員的tcp1基因敲除突變體顯示出生長(zhǎng)速度降低，并逐漸發(fā)育成卷曲的葉狀體。所有這些生長(zhǎng)缺陷都可以用包含TCP1位點(diǎn)的6.8kb基因組片段完全回補(bǔ)。接下來(lái)，為了評(píng)估TCP1在3D基因組組織中的潛在作用，研究人員從Tak-1植物中產(chǎn)生了對(duì)應(yīng)于兩個(gè)獨(dú)立的tcp1株系的兩個(gè)Hi-C數(shù)據(jù)集和另一個(gè)Hi-C數(shù)據(jù)集。在染色體尺度上，tcp1突變體Hi-C圖譜顯示出與野生型植物高度相似的A/B區(qū)段模式，表明基因組組織沒(méi)有顯著變化。關(guān)于局部染色質(zhì)的相互作用，研究人員檢查了tcp1 Hi-C圖譜是否顯示TADs的變化，其中TCP1與其邊界相關(guān)。然而，兩個(gè)獨(dú)立的tcp1突變系的Hi-C圖譜并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)它們的TAD模式有明顯的變化(圖2D)。對(duì)其進(jìn)行的定量比較表明，TCP1的丟失不會(huì)導(dǎo)致這些TAD邊界發(fā)生系統(tǒng)變化(圖2E)。然而，將TCP1結(jié)合的TAD邊界的變化與不結(jié)合TCP1的TAD邊界的變化進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)上的細(xì)微差別。然而，對(duì)TCP1結(jié)合的TAD邊界周圍的染色質(zhì)模式的檢查沒(méi)有發(fā)現(xiàn)突變體中有任何明顯的變化。研究人員推測(cè)，TCP1結(jié)合基因在TAD邊界的轉(zhuǎn)錄變化導(dǎo)致了Hi-C圖譜上的細(xì)微差異，因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄狀態(tài)本身被證明是Hi-C模式的有力預(yù)測(cè)因子?？傮w而言，兩個(gè)tcp1突變體株系在TCP1結(jié)合的TAD邊界上都沒(méi)有表現(xiàn)出劇烈的變化，這意味著TCP1對(duì)于地錢草中的TAD結(jié)構(gòu)不是必不可少的。

3   一些MCG缺乏的TAD小體與TCP1有強(qiáng)烈的相互作用

對(duì)TCP1 Chip-Seq峰和Hi-C圖的研究顯示了一種密集的TCP1-染色質(zhì)相互作用的TAD(圖3A)。在地錢草基因組中，這種類型的TAD，與TCP1 Chip-Seq峰顯示出相當(dāng)大的重疊，發(fā)生的頻率比偶然的要高(圖3B)。為了進(jìn)一步描述這些TADs，研究人員隨意地將TCP1峰覆蓋了至少20%的TAD區(qū)域的TADs命名為“富含TCP1”的TADs?？偣泊_定了456個(gè)富含TCP1的TADs。值得注意的是，根據(jù)DNA甲基化，富含TCP1的TADs幾乎完全屬于MCG貧乏的TAD類別，或者根據(jù)組蛋白標(biāo)記屬于“簇4”(圖3C，D)。與其他TAD相比，簇4中的成員在TAD小體上具有更高的H3K9ac和H2A.Z水平。接下來(lái)，研究人員使用TCP1的免疫染色結(jié)合FISH(熒光原位雜交)來(lái)檢測(cè)TCP1蛋白和富含TCP1的TADs的空間定位。在細(xì)胞核中，TCP1蛋白并不均勻分布在核質(zhì)中，而是表現(xiàn)出斑點(diǎn)狀(圖4A，B)。此外，研究人員觀察到富含TCP1的TADs定位于TCP1蛋白斑點(diǎn)中(圖4C-F)。與MCG貧乏的TAD類別中的其他成員相比，富含TCP1的TADs具有不同的表觀遺傳方式，但染色質(zhì)可及性和其他基因組特征相似。富含TCP1的TADs缺乏活性常染色質(zhì)標(biāo)記，包括H3K4me1、H3K4me3和H3K36me3；然而，它們也缺乏H3K27me3，這是沉默蛋白編碼基因的標(biāo)志。這些模式表明，與其他TADs相比，富含TCP1的TADs定義了一種具有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域。

大約22.6%的TCP1靶區(qū)位于富含TCP1的TADs內(nèi)(圖5A)。通過(guò)檢查富含TCP1的TADs上的TCP1 Chip-Seq數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)這些TAD邊界上TCP-染色質(zhì)相互作用強(qiáng)度的急劇轉(zhuǎn)變(圖5B)，這意味著TCP1-染色質(zhì)相互作用和富含TCP1的TADs的建立之間可能存在反饋。位于富含TCP1的TADs內(nèi)部的TCP1-染色質(zhì)相互作用似乎不同于外部的TCP1-染色質(zhì)相互作用。在所有已鑒定的TCP1 Chip-Seq峰中，那些位于富含TCP1的TADs中的峰要寬得多，它們之間的距離也較小(圖5C，D)，這表明富含TCP1的TADs定義了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域，具有增強(qiáng)的TCP1-染色質(zhì)相互作用。在這兩個(gè)tcp1基因敲除系中，研究人員發(fā)現(xiàn)富含TCP1的TADs系統(tǒng)性地向較低的值移動(dòng)；作為對(duì)照，在屬于MCG貧乏TADs類別的“無(wú)TCP”TADs中沒(méi)有觀察到這樣的變化(圖5E)。然而，tcp1的這一統(tǒng)計(jì)顯著變化并未顯示富含TCP1的TADs的結(jié)構(gòu)變化，因?yàn)樗鼈兊娜旧|(zhì)相互作用模式仍然與Tak-1高度相似(圖5F)。因此，盡管TCP1與許多TAD邊界(圖2)和富含TCP1的TADs(圖5)相連，但TCP1似乎對(duì)地錢草中TADs的形成不是必須的。

圖4. 富含TCP1的TADs是細(xì)胞核中TCP1蛋白斑點(diǎn)的一部分。A, B 抗TCP1抗體免疫組化染色：野生型核(TAK-1)(A),TCP1基因敲除核(B)。C-F TCP1蛋白的空間定位和富含TCP的TADs的篩選。Hi-C圖譜,TCP1 Chip-Seq信號(hào)以及免疫染色和FISH數(shù)據(jù)顯示了5號(hào)染色體(C，D)和2號(hào)染色體(E，F(xiàn))上一個(gè)富含TCP1的TAD，其中標(biāo)有藍(lán)色片段的TAD區(qū)域被標(biāo)記為FISH。

圖5. 關(guān)于TCP1-染色質(zhì)相互作用的富含TCP1的TADs的特征。A 顯示TCP1 Chip-Seq峰分布的餅圖。B 分析富含TCP1的TADs上的TCP1-染色質(zhì)相互作用。C，D 比較TCP1 Chip-Seq峰寬(C)和密度(D)。E 野生型和tcp1突變體TADs的隔離數(shù)值比較。F 在tcp1突變體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)富含TCP1的TADs的劇烈變化。

4   富含TCP1的TADs為基因表達(dá)提供了抑制環(huán)境

如上所述，TCP1可以直接與活性基因和抑制基因結(jié)合(圖2C)。有趣的是，位于TCP1豐富的TADs中的TCP1靶基因比分布在基因組其他地方的TCP1靶基因的表達(dá)活性要低得多(圖6A，B)。這與研究人員的觀察結(jié)果相關(guān)，即富含TCP1的TADs被H3K36me3修飾耗盡，這表明在富含TCP1的TADs中，TCP1蛋白與抑制環(huán)境有關(guān)。

接下來(lái)，研究人員比較了tcp1突變轉(zhuǎn)錄組和野生型轉(zhuǎn)錄組，以深入了解基因表達(dá)是如何受到影響的，特別是關(guān)于富含tcp1的TADs。研究人員發(fā)現(xiàn)與TCP1有廣泛相互作用的基因在tcp1中往往會(huì)上調(diào)。在基因組水平上，TCP1目標(biāo)基因比未被TCP1結(jié)合的基因顯示出更大程度的表達(dá)變化。有趣的是，TCP1靶基因的基因表達(dá)變化程度也與3D基因組位置有關(guān)。根據(jù)TCP1靶基因是否與哪種類型的TAD重疊對(duì)TCP1靶基因進(jìn)行分組后，研究人員發(fā)現(xiàn)那些駐留在TCP1豐富的TADs中的基因表達(dá)變化最大(圖6C)。需要注意的是，大量的TCP1非靶基因在tcp1中存在差異表達(dá)。事實(shí)上，在tcp1突變體中，大多數(shù)差異表達(dá)的基因都是tcp1非靶基因。在突變體中上調(diào)和下調(diào)的1595個(gè)和760個(gè)基因中，只有37.9%(605/1595)和29.2%(222/760)分別與TCP1結(jié)合，表明TCP1轉(zhuǎn)錄組的變化主要反映了TCP1缺失的間接影響。TCP1的缺失不僅影響了TCP1富含TADs中的TCP1靶基因，也影響了TADs中駐留的TCP1非靶基因。對(duì)于TCP1非靶標(biāo)，研究人員發(fā)現(xiàn)更多的差異表達(dá)基因位于TCP1豐富的TADs中。此外，與富含TCP1的TADs重疊的TCP1非靶基因顯示出比其他基因更大的表達(dá)變化(圖6D)。因此，不管它們是否被TCP1結(jié)合，富含TCP1的TADs中的基因在TCP1中的表達(dá)變化程度比基因組中其他基因要大。

圖6. TCP1缺失對(duì)基因表達(dá)的影響。A 根據(jù)基因相對(duì)于TADs的位置分組的基因表達(dá)。B TCP1靶基因定位與表達(dá)的相關(guān)性。C，D 小提琴圖譜顯示tcp1基因敲除突變體的基因表達(dá)分布變化。

在本研究中，研究人員詳細(xì)分析了地錢草基因組常染色體上的TADs。研究人員發(fā)現(xiàn)，根據(jù)它們的表觀遺傳狀態(tài)，它們可以分為不同的類型。研究人員揭示了一種含有地錢草 TCP1轉(zhuǎn)錄因子的TAD，研究人員稱之為“富含TCP1的TADs”。然而，TCP1功能的喪失不會(huì)導(dǎo)致3D染色質(zhì)組織或富含TCP1的TAD結(jié)構(gòu)的急劇改變。在tcp1突變體中，與位于這些TADs之外的基因相比，位于TCP1豐富的TADs中的基因表現(xiàn)出更大的表達(dá)變化。研究人員的工作揭示了一種含有大量轉(zhuǎn)錄因子的植物TAD，它定義了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能核區(qū)。

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