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編譯：劉娟，編輯：景行、江舜堯。

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原名：Global Gene Expression Analysis Identifies Age-Related Differences in Knee Joint Transcriptome during the Development of Post-Traumatic Osteoarthritis in Mice

譯名：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析追蹤移植造血干細(xì)胞的分化

期刊：Nature Cell Biology

IF：20.042

發(fā)表時間：2020年6月

通訊作者：程濤；Berthold Go?ttgens

通訊作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，劍橋大學(xué)

DOI號：10.1038/s41556-020-0512-1 

1    小鼠造血細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組

scRNA-seq分析成年C57BL/6小鼠骨髓(BM)或脾臟(SP)28個造血細(xì)胞群，建立 血液系統(tǒng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫(圖1a)。利用成熟的細(xì)胞表面標(biāo)記物熒光激活細(xì)胞分選法分離單細(xì)胞，共有1270個單細(xì)胞通過質(zhì)量控制(≥1000個基因表達(dá))，被用于繪制血液系統(tǒng)圖譜。單細(xì)胞造血干／祖細(xì)胞數(shù)據(jù)的擴散映射顯示清晰的譜系分支，與之前發(fā)表的數(shù)據(jù)集高度吻合，證明本研究測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性。

然后，系統(tǒng)比較免疫表型定義的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。主成分分析(PCA)和非監(jiān)督層次聚類顯示免疫表型HSCs具有顯著的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(iHSCs；圖1b)，5種類型的iHSCs被分為三個不同轉(zhuǎn)錄特征群：tHSC1、tHSC2和tHSC3(圖1c)。Egr1和Nr4a1、Sh3gl1和S100a9、Cd79a和Blnk分別在tHSC1、tHSC2和tHSC3中特異性高表達(dá)(圖1d)。tHSC1包含不同比例的所有iHSCs，而tHSC2包含4個群體的iHSCs，除了基因片段III，它占tHSC3的85%以上(圖1e)。相比之下，除基因片段III外，每個iHSC群中有50-71%細(xì)胞為tHSC1細(xì)胞，29-45%細(xì)胞為tHSC2細(xì)胞。基因片段III由70%的tHSC1和30%的tHSC3組成，不含tHSC2(圖1f)。

圖1.iHSCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。a，對28個細(xì)胞群(共1270個細(xì)胞)進行scRNA-seq,代表造血細(xì)胞經(jīng)典層次。CLP，共同淋巴祖細(xì)胞；CMP，普通骨髓祖細(xì)胞；EryA和EryB，紅細(xì)胞A和B；GMP,粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞；MEP，巨核細(xì)胞－紅細(xì)胞祖細(xì)胞；NK,自然殺傷細(xì)胞。b，5個iHSCs群體中不同表達(dá)基因的熱圖和非監(jiān)督層次聚類。右側(cè)列出每個簇中特異性表達(dá)基因的代表性GO富集。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組譜將三簇HSCs (tHSC1、tHSC2和tHC3)分組。ER,內(nèi)質(zhì)網(wǎng);HSC^LT,長期HSC。c, UMAP顯示5個iHSC群中的3個異質(zhì)性群:tHSC1(n=189)，tHSC2 (n=93)和tHSC3(n=23)d,tHSC1(n=189)、tHSC2 (n=93)和tHSC3(n=23)中特異性表達(dá)基因歸一化表達(dá)值(log₂(TPM/10+1))分布的箱形圖。e, 5個iHSC群體(tHSC1:n=189,tHSC2:n=93,tHSC3:n=23)中每個tHSC組成的直方圖。f，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組成的餅圖(HSC^LT:n=22；基因I:n=102；基因III:n=66；ESLAM (EPCR⁺CD150⁺CD48^-CD45⁺):n= 58；ESLAMSK:n=57)。

9種免疫表型多能性祖細(xì)胞(iMPPs)被分為5個不同轉(zhuǎn)錄特征群：tMPP1、tMPP2、tMPP3、tMPP4和tMPP5(圖2a)。iMPPs和 tMPPs的轉(zhuǎn)錄組成均表現(xiàn)出較大轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(圖2b,c)。基因表達(dá)譜將祖細(xì)胞,紅細(xì)胞,巨核細(xì)胞,粒細(xì)胞,單核－巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚為一類,稱為tCP1-3(祖細(xì)胞),tME1-3 (巨核細(xì)胞－紅細(xì)胞)，tGM1-3 (粒細(xì)胞－單核細(xì)胞－巨噬細(xì)胞)和tLym1-4 (淋巴細(xì)胞－淋巴細(xì)胞)，然后根據(jù)免疫表型細(xì)胞計算這些群體的組成。轉(zhuǎn)錄組分析將28個造血群體分為21個群，每個簇都特異性表達(dá)與功能相關(guān)特征的獨特生物學(xué)過程富集的基因。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，大多數(shù)tHSCs和tLyms如預(yù)期那樣處于靜止?fàn)顟B(tài)，但tMPPs和tCPs在細(xì)胞周期狀態(tài)方面具有顯著的變化。基因集富集分析(GSEA)顯示，與tHSC2或tHSC3相比，tHSC1表現(xiàn)出最強HSC標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄活性，與它們的靜態(tài)標(biāo)志一致。此外，基于巨核細(xì)胞、紅系、髓系和淋巴系相關(guān)基因的共表達(dá)，推測多系分化潛能在tHSC1中比tHSC2中更豐富，而tHSC3似乎更傾向于向紅系和淋巴系分化。tMPP1表現(xiàn)出較高的HSC標(biāo)志基因，tMPP2活躍表達(dá)前巨核細(xì)胞-紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞祖特征基因。相比之下，tMPP3表達(dá)前粒細(xì)胞單核細(xì)胞特征基因，而tMPP5表達(dá)共同的淋巴祖細(xì)胞。這些結(jié)果符合移植結(jié)果驗證的基于iMPPs的tMPP組成(圖2c)。與已發(fā)表的數(shù)據(jù)一致，Procr,Esam和Necdin等基因也在tHSCs和/或tMPP中選擇性表達(dá)。

值得注意的是，tHSC3在軌跡圖上與tHSC1和tHSC2明顯不同(圖2d)，而且tHSC3在很大程度上與基因III重疊，之前研究和我們的數(shù)據(jù)分析顯示，基因III具有長期的淋巴細(xì)胞偏倚重建潛能。因此，tHSC3可能在功能上更多地與短期HSC或MPPs相關(guān)。tMPP1細(xì)胞在細(xì)胞周期中比tHSCs更活躍，分化軌跡分析表明，它們的分化潛能接近(圖2d)。總的來說，該軌跡圖在上半部分與造血干細(xì)胞到MPPs的連續(xù)過程一致，在下半部分有明確的髓系和淋巴系分支。因此，這21個轉(zhuǎn)錄組定義的細(xì)胞簇是評估應(yīng)激條件下細(xì)胞特性的有力參考工具，特別是當(dāng)細(xì)胞表面標(biāo)記不穩(wěn)定或細(xì)胞產(chǎn)量低導(dǎo)致移植后不久無法對移植的造血干細(xì)胞進行詳細(xì)表型分析時。

圖2.iMPPs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及造血細(xì)胞的軌跡分析。a, 9個iMPP群體中不同表達(dá)基因的熱圖和無監(jiān)督層次聚類。右側(cè)列出每個簇中特異性表達(dá)基因的代表性GO富集。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組譜將tMPPs分為5類(tMPP1-5)。HSC^ST表示短期HSC。b,9個iMPP群體中每個tMPP組成的直方圖(tMPP1：n= 100；tMPP2:n=145；tMPP3:n=95；tMPP4:n=93；tMPP5:n=75)。c,tMPPs顯示各iMPP組成的直方圖(HSCST:n=41；LMPP(CD34⁺CD135⁺LSK):n=31；MPP1-4:n=72、72、76、78；基因II: n=49；HPC2: n=44；HPC3:n=45)。d，Monocle算法對血液系統(tǒng)(共21個細(xì)胞簇)的軌跡分析。

2   移植后HSC向mosaic祖細(xì)胞的分化

基于上述轉(zhuǎn)錄組所有造血細(xì)胞類型的特征，研究者試圖追蹤受輻射個體移植后HSC的性質(zhì)。從綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠(B6-Ly5.2, GFP⁺)中純化的HSC (CD201⁺150⁺48?45⁺Sca-1⁺c-Kit⁺ (ESLAMSK))共1000-4000個，與3×10⁵個競爭細(xì)胞(B6-Ly5.2, GFP^-)一起移植到受輻射個體(B6-Ly5.2)中。在移植后第1、3、5和7天收集供者GFP⁺細(xì)胞(57個移植受者的1031個細(xì)胞)，開展scRNA-seq(圖3a)。供體GFP⁺細(xì)胞采集率極低(第1、3、5和7天分別為0.005±0.007%、0.006±0.004%、0.012±0.009%和0.22±0.292%)；具有代表性的流式細(xì)胞圖見圖3b。與移植后ESLAMSK細(xì)胞相比，供體細(xì)胞整體基因表達(dá)早在移植后第1天就發(fā)生顯著變化。通過對轉(zhuǎn)錄因子(TF)調(diào)控因子的分析，進一步闡明轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)轉(zhuǎn)錄活性。編碼自我更新相關(guān)TFs基因（如Egr1、Egr3、Gata2和Hmga2）逐漸下調(diào)。髓系細(xì)胞(Cebpa、Cebpab、Cebpad和Cebpae)和紅細(xì)胞－巨核細(xì)胞(Irf2)相關(guān)的TFs基因在移植后第1天表達(dá)上調(diào)并共表達(dá)。這些結(jié)果表明，移植的造血干細(xì)胞和/或其后代表現(xiàn)出弱自我更新特征，并在移植后的非常早期階段采用一種轉(zhuǎn)錄程序?qū)⑵湎拗圃谝粋€或多個譜系。

根據(jù)穩(wěn)態(tài)下細(xì)胞類型特異性的特征基因?qū)⒁浦布?xì)胞分為21個細(xì)胞簇,這些細(xì)胞身份相關(guān)基因在移植后的單個細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)。動態(tài)平衡狀態(tài)下所有造血細(xì)胞的t分布隨機鄰域嵌入圖(圖3c)顯示,移植后1周內(nèi)tHSCs、tMPPs、tMEs和tGMs再生，而tCPs和tLyms很少(圖3d)。與注射tHSCs相比，移植后每天的細(xì)胞組成清楚表明移植的HSCs定向成為tMPPs，甚至在第1天產(chǎn)生少量tMEs和tGMs(圖3e,f)。從移植后1周內(nèi)的細(xì)胞動力學(xué)來看，tHSCs(主要是tHSC1和tHSC2)的比例逐漸下降，而tMPPs是主要的人群，甚至在第1天和第7天出現(xiàn)一些tMEs和tGMs(圖3f,g)。每個代表性受體的細(xì)胞重組表明，tMPPs在移植后不久即成為主要的細(xì)胞類型。第1天和第7天出現(xiàn)部分譜系性細(xì)胞，特別是tMEs(17個受者中有6個)和tGMs(8個受者中有2個)(圖3h)。為排除第1天采集的細(xì)胞存在取樣偏倚可能性，另收集137個供體骨髓和脾臟細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞分類結(jié)果與圖2g所示一致，符合移植的造血干細(xì)胞在1周內(nèi)立即分化為祖細(xì)胞和譜系細(xì)胞(tMEs和tGMs)的模型。

移植后HSC第1天的轉(zhuǎn)錄組快速變化促使研究者思考轉(zhuǎn)錄組改變是否依賴于細(xì)胞分裂。為此，將CellTrace Violet染色的供體HSC移植到受體小鼠體內(nèi)，移植后收集發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)供體細(xì)胞在第1天保持不分裂，但從第3天到第7天逐漸分裂(圖4a-c)，表明造血干細(xì)胞MPP轉(zhuǎn)錄組譜不依賴于細(xì)胞分裂。

圖3.造血干細(xì)胞移植后植入細(xì)胞的組成。a，供體GFP⁺細(xì)胞移植后scRNA-seq實驗設(shè)計。b，供體GFP⁺細(xì)胞在指定時間點(第1、3、5和7天)的代表性流式細(xì)胞術(shù)圖。第1、3、5和7天分別有6、6、2和2個生物重復(fù)。c，穩(wěn)態(tài)下所有單細(xì)胞的t-SNE圖。共21個細(xì)胞簇，包括tHSC1-3、tMPP1-5、tCP1-3、tME1-3、tGM1-3和tym1-4。d，供體單細(xì)胞移植后第1天至第7天的t-SNE圖。e，移植細(xì)胞(輸入)和供體細(xì)胞在t-SNE圖上顯示輸出時間點的分布和細(xì)胞動力學(xué)。f，移植后第1、3、5、7天各細(xì)胞類型的動態(tài)頻率。g，輸出細(xì)胞中不同亞組在指定時間點的動態(tài)頻率。h，每個代表性受體小鼠在不同時間點的輸出細(xì)胞類型組成。tLineages包括tMEs,tGMs和tLyms。

圖4.供體細(xì)胞移植后的細(xì)胞分裂情況。a.用細(xì)胞示蹤紫染色BM c-Kit⁺培養(yǎng)細(xì)胞2天，用細(xì)胞示蹤紫熒光強度流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞分裂。b.骨髓移植后第1、3、5和7天染色的供體細(xì)胞代表性流式細(xì)胞術(shù)圖。c.骨髓移植和SP中供體細(xì)胞分裂數(shù)的直方圖。數(shù)值代表平均值±s.e.m.

3   移植后HSCs中HSC和MPP亞型的動態(tài)變化

進一步分析tHSC1和tHSC2移植后的轉(zhuǎn)錄組變化(簡稱Tx tHSC1/2)。與輸入HSC相比，輸出tHSC1和tHSC2表現(xiàn)出造血干細(xì)胞信號的下調(diào)(圖5a)。tHSC1的增殖特征減弱，而tHSC2的增殖特征增強，這與循環(huán)細(xì)胞中輸出tHSC2相對于輸入tHSC2增加的比例一致(圖5a,b)。至于假定的分化潛能，tHSC1在巨核細(xì)胞系、紅系和髓系分化上富集降低。相反，tHSC2被誘導(dǎo)向紅系和髓系分化(圖5c)。與穩(wěn)態(tài)下的同類相比，Tx tHSC1/2在淋巴、凋亡或自噬信號富集方面沒有差異(圖5c)?；赥x tHSC1/2細(xì)胞增殖和分化偏向性的改變，研究者認(rèn)為tHSC2細(xì)胞為滿足分化功能細(xì)胞需要而呈現(xiàn)出激活反應(yīng)(啟動狀態(tài))，而tHSC1細(xì)胞在再生壓力下維持HSC池，處于靜止?fàn)顟B(tài)。這一模式與之前功能性研究一致，表明功能性HSC的兩種不同細(xì)胞狀態(tài)。

接下來研究tMPPs，它是移植后造血干細(xì)胞快速進化而來的主要成分。tMPP1在第3天占供體細(xì)胞的30%以上，在第7天持續(xù)下降至5%以下。tMPP2在第5天占40%以上，在第7天下降到20%。tMPP3的頻率最初小于5%，在第7天急劇上升到30%。tMPP4維持在低頻率，而tMPP5在移植后第5天逐漸升高到20%(圖5d)。tMPP2和tMPP3的頻率增加伴隨著S/G2/M細(xì)胞周期信號的百分比升高。

GSEA利用特定基因進一步研究tMPPs的分化譜，并與相應(yīng)的對照在穩(wěn)態(tài)條件下進行比較(圖5e)。tMPP1表現(xiàn)出更高的增殖特征，有利于向紅系和髓系分化，并抑制巨核細(xì)胞。tMPP2對髓系基因呈正富集，對巨核基因呈負(fù)富集。tMPP3和tMPP4分別表現(xiàn)為紅系和巨核基因富集。與巨核細(xì)胞、紅系細(xì)胞和髓系細(xì)胞相關(guān)的基因集在tMPP5中富集，而淋巴潛能被抑制。具體來說，紅細(xì)胞(Phb2和Nfia)、巨核細(xì)胞(Pf4和Vwf)、髓系細(xì)胞(Spi1和Cebpd)和淋巴細(xì)胞(Flt3和Satb1)的代表性TF或標(biāo)記基因在不同的tMPPs上表達(dá)可能觸發(fā)移植后譜系分化。與穩(wěn)態(tài)下相比，移植后tMPPs(簡稱Tx tMPPs)表現(xiàn)出應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因Ifitm3、S100a6和Serpina3g的上調(diào)，B細(xì)胞分化基因Ramp1、Cd52和Pnp的下調(diào)(圖5f,g)。氧化磷酸化、剪接體和RNA轉(zhuǎn)運途徑與1周內(nèi)tMPPs的動態(tài)變化有關(guān)。表面蛋白CD201、CD150和CD48的表達(dá)變化支持移植后1周內(nèi)的細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變(圖5h)。總的來說，這些結(jié)果表明，Tx tMPPs中髓系和紅系分化穩(wěn)定，而淋巴細(xì)胞分化受到抑制。

圖5.移植HSC的時間命運變化及分化趨勢。a，與HSC特征相關(guān)的基因GSEA(上)和增殖(下)比較Tx的tHSC1/2和ESLAMSK的tHSC1/2。b，穩(wěn)態(tài)下，Tx tHSC1/2在指定時間點的細(xì)胞周期所占百分比(Tx tHSC1/2的n分別為16和15,tHSC1/2的n分別為189和93)。c，與ESLAMSK tHSC1/2相比，Tx tHSC1/2與ESLAMSK tHSC1/2分化(巨核、紅系、髓系和淋巴系)特征的GSEA (a和c, Tx tHSC1/2分別為16和15,ESLAMSK tHSC1/2分別為34和22)。d,總共tMPP1-5供體細(xì)胞的百分比表示時間點(在1、3、5和7天，tMPP1的n=32,53,68和16, tMPP2的n=28,53,170和97, tMPP3的n=1,0,6和107,tMPP4的n=6,4,20和26, tMPP5的n=10,17,76和63)。e，移植后tMPP1-5(縮寫為Tx tMPP1-5, n分別為169、348、114、56和166)與穩(wěn)態(tài)(n分別為100、145、95、93和75)的提示信號GSEA。f，火山圖顯示差異表達(dá)基因(dots)比較在穩(wěn)態(tài)下(n=508)和移植后(n=853)的tMPPs。紅點、綠點分別代表上調(diào)基因和下調(diào)基因。g, GO的上調(diào)(紅色)和下調(diào)(藍(lán)色)基因比較Tx tMPPs和tMPPs。h，流式細(xì)胞儀顯示供體細(xì)胞在移植后第1天和第7天的表面標(biāo)志物。

4   tHSC豐富度逐漸減少的功能驗證

使用單細(xì)胞集落形成試驗和二次移植來檢測供體細(xì)胞移植后的植入和分化潛能。與新鮮HSC相比，供體細(xì)胞的集落形成率降低(第1、3、5和7天，供體細(xì)胞的集落形成率分別為12.93±5.85%、23.95±6.66%、10.05±3.95%和21.2±4%，而新鮮HSC的集落形成率為62.34±8.34%)(圖6a)。細(xì)胞從第1天和第3天生成50-80%非常小(直徑<0.3毫米)和小(直徑在0.3-1毫米)克隆,而細(xì)胞從第5天和第7天生成50-60%中型(直徑1-2毫米)和大型(>2毫米直徑)克隆(圖6b)。此外，第1天和第3天供體細(xì)胞的多譜系菌落(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞)與新鮮HSC相當(dāng)，而第5天和第7天供體細(xì)胞的多譜系潛能略有下降(圖6c)。重要的是，第1天從受體骨髓和脾臟中回收的GFP⁺細(xì)胞在二次移植中表現(xiàn)出持續(xù)的多譜系植活度。同時，在第3、5、7天恢復(fù)的細(xì)胞中，即使收集到更多的細(xì)胞，重構(gòu)效率和植入水平也逐漸下降(圖6d)。這些數(shù)據(jù)表明，移植后HSC匹配的概率立即下降，與scRNA-seq分析的結(jié)果一致。盡管大多數(shù)注射的造血干細(xì)胞在其轉(zhuǎn)錄組譜基礎(chǔ)上類似MPPs，第1天(未分裂)收集的細(xì)胞仍然具有HSC的長期移植能力。

進一步明確首次移植后收集的供體細(xì)胞長期持續(xù)重建的細(xì)胞來源。將聚乙乙烯醇(PVA)為基礎(chǔ)的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)用于從第1天到第3天收集的細(xì)胞培養(yǎng)48小時，然后進行scRNA-seq。移植后的細(xì)胞大多在培養(yǎng)后分化，這些細(xì)胞中的少數(shù)與新鮮造血干細(xì)胞保持相同的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)(圖6e)。有限稀釋法 (LDA)顯示,HSC的重組效率第1天和第3天遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在第5天和第7天。因此，所有這些體內(nèi)外分析與模型一致,即移植后早期的長期重建潛能主要來自保留的小部分tHSCs，這些干細(xì)胞既保持其分子狀態(tài)，又保持其功能狀態(tài)。

圖6.供體細(xì)胞移植后功能評估。a，移植后收集供體細(xì)胞與新鮮ESLAMSK細(xì)胞集落形成率。新鮮、第1天、第3天、第5天、第7天集落形成率分別為62.34±8.34(n=4)、12.93±5.86(n=3)、23.95±6.66(n=3)、11.26±6.38(n=2)、21.22±4.00(n=2)。新鮮ESLAMSK細(xì)胞和供體細(xì)胞的菌落大小。根據(jù)菌落直徑(d)將菌落大小分為4種類型(新鮮、第1天、第3天、第5天、第7天的n分別為82、21、56、16和103)。c，細(xì)胞離心和Giemsa染色后形態(tài)學(xué)鑒定的菌落類型(新鮮、第1天、第3天、第5天、第7天分別為n=66、13、48、13、45)。E,成紅血球細(xì)胞;m,巨噬細(xì)胞;M,巨核細(xì)胞;n,中性粒細(xì)胞。d，首次移植后指定時間點從骨髓(上)和脾臟(下)收集供者細(xì)胞，在受體PB中進行移植。移植細(xì)胞的數(shù)目列在下面，分別于移植后第1、3、4個月監(jiān)測細(xì)胞的再生情況 (第1、3、5、7天，觀察骨髓收集細(xì)胞n=2,4,4,2，觀察脾臟收集的細(xì)胞n=1,4,3,3)。e，柱狀圖顯示有或沒有PVA培養(yǎng)的細(xì)胞基于轉(zhuǎn)錄組分類組成。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組圖譜對細(xì)胞亞群進行分類，新分離的ESLAMSK細(xì)胞(56個細(xì)胞)和培養(yǎng)后的ESLAMSK細(xì)胞(91個細(xì)胞),第1天收集供體細(xì)胞(50個細(xì)胞)和第1天培養(yǎng)后(112細(xì)胞), 第3天收集供體細(xì)胞 (77個細(xì)胞) 和第3天培養(yǎng)后 (133細(xì)胞)細(xì)胞測序。

5   移植后HSC的紅系和髓系前體

令人驚訝的發(fā)現(xiàn)是移植后造血干細(xì)胞tMEs和tGMs的早期分化(圖3g,h)。在供體總細(xì)胞中，tMEs和tGMs的頻率在第1天達(dá)到約10%，然后在第3天和第5天急劇下降到0%，但在第7天再次上升到10%(圖7a)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，第1天和第7天的Ter119⁺和Mac-1+Gr-1⁺細(xì)胞分別占20%和10%(圖7b)。這些數(shù)據(jù)表明，移植后HSC可能最早在第1天通過“旁路”途徑直接程序化進入紅系和髓系，這與最近的一項研究一致，即HSC分化可以發(fā)生在第一次細(xì)胞分裂之前。單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄定量PCR (qRT-PCR)顯示，供體Ter119⁺細(xì)胞在第1天表現(xiàn)出更高的干細(xì)胞相關(guān)基因(Kit、Slamf1、Fgd5和Gata2)、巨核細(xì)胞(Pf4和Selp)和紅系基因(Lmo2和Tal1)的表達(dá)。供體Mac-1+Gr-1⁺細(xì)胞表現(xiàn)出類似髓系基因表達(dá)(Csf1r、Csf2rb和Csf3r)(圖7c)。此外，免疫應(yīng)答相關(guān)基因第1天在tMEs中高表達(dá)，第7天靶向膜蛋白相關(guān)基因的表達(dá)水平升高(圖7d)。這些數(shù)據(jù)表明，tMEs第1天的不成熟狀態(tài)可能是由微環(huán)境中應(yīng)激反應(yīng)觸發(fā)。與外周血(PB)血清中穩(wěn)態(tài)對照相比，紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)這兩種主要的生長因子分別參與紅細(xì)胞分化和髓系分化，在移植后紅細(xì)胞生成素(EPO)和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的蛋白水平顯著升高(圖7e,f)。升高的細(xì)胞因子水平可促進有限的譜系分化。因此，移植后tMPP2、tMPP3、tCP1、tME1和tGM1中Ifitm1的表達(dá)顯著增加，表明紅系和髓系分化程序激活。總的來說，這些數(shù)據(jù)證實移植后造血干細(xì)胞和/或骨髓基質(zhì)細(xì)胞存在早期的紅細(xì)胞和骨髓細(xì)胞偏倚分化，但這些“分化”細(xì)胞仍然保持某些未成熟的特征，它們的生理作用和意義，尤其是在壓力或損傷條件下，值得進一步研究。

圖7.HSC移植早期細(xì)胞前體的出現(xiàn)。a，在指定時間點，tMEs和tGMs在供者總細(xì)胞中的百分比(移植后第1,3,5和7天，tGMs中n=14,1,5和56，tMEs中n=19,1,1和31)。b，移植后第1天和第7天供體細(xì)胞(GFP⁺細(xì)胞)中Ter119和Mac-1/Gr-1表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)圖。Don代表供者；Rec代表受者。c，第1天通過單細(xì)胞qRT-PCR比較供體Ter119⁺細(xì)胞與受體Ter119⁺細(xì)胞(左)、供體Mac-1⁺/Gr-1⁺細(xì)胞與受體Mac-1⁺/Gr-1⁺細(xì)胞(右)特異性表達(dá)基因的熱圖。d，移植后第1天和第7天差異表達(dá)基因的時間熱圖，以及第1天(綠色)和第7天(紅色)富集上調(diào)基因的GO terms。e，指定時間點PB血清中EPO濃度。對照(Ctrl)、第1天、第3天、第5天和第7天EPO水平分別為0.03±0.04(n=3)、0.13±0.01(n=3)、0.28±0.07(n=7)、0.42±0.22(n=6)和1.52±0.33 (n=4)。f，指定時間點PB血清中G-CSF濃度。對照組、第1天、第3天、第5天和第7天G-CSF水平分別為0.38±0.11(n=3)、1.73±0.54(n=7)、18.33±6.30(n=7)、34.21±9.90(n=6)和45.45±17.45(n=5)。

本文scRNA-seq數(shù)據(jù)為血液系統(tǒng)不同分化階段和譜系的細(xì)胞特性分類提供參考。成人骨髓造血譜系分化的分支早在tHSC和tMPP階段就出現(xiàn)。大多數(shù)移植HSC都定向成為tMPPs，傾向于分化為紅-巨核系和骨髓系，與穩(wěn)態(tài)下的造血系統(tǒng)形成鮮明對比，這可能是主要的造血動力來源。

由于scRNA-seq的破壞性，本文開展的時間過程測量依賴于順序快照測量。多種調(diào)控機制可能參與HSCs的動態(tài)過程，但功能研究符合scRNA-seq測量推斷的移植HSC有限自我更新和快速分化的假設(shè)。在條件性受體中注射HSCs，部分HSC可能出現(xiàn)凋亡增加或歸巢效率低下。本文重點討論能成功存活并歸巢的移植細(xì)胞特征和功能。至于供體HSC的行為，轉(zhuǎn)錄分析和功能評估都表明，移植細(xì)胞的增殖伴隨著造血干細(xì)胞的相對比例逐漸下降。至關(guān)重要的是，增殖、分化和干細(xì)胞之間存在平衡,在種群水平上保留HSC功能(圖3g和6c)。重建可能來自第1天和第3天罕見的保留HSCs,但我們不能排除部分分化細(xì)胞可能在重建過程（第1周以后）后期恢復(fù)到HSC狀態(tài),這值得進一步研究。

本研究基于功能、免疫表型的經(jīng)典定義,利用scRNA-seq對HSC或其他再生細(xì)胞群進行單細(xì)胞分辨率下轉(zhuǎn)錄組分類，全面分析和跟蹤干細(xì)胞如何更好的適應(yīng)和修補受損或病變組織,對進一步探索和改進干細(xì)胞治療具有重要意義。

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