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本文以植物為試材, 介紹二種常用的植物組織RNA的提取方法———試劑盒法和trizol法。

在提取RNA之前，準(zhǔn)備工作是必須要進(jìn)行的，這決定了RNA提取的成敗與否。

一、儀器準(zhǔn)備和消毒

首先是實(shí)驗(yàn)器具和儀器的清理和消毒，需要用到的器材和溶液有：研磨棒、研缽（有研磨儀的可不用研磨棒和研缽）、剪刀、鑷子、鋼珠、液氮、RNase free的離心管和圓底EP管、DEPC水（1ml DEPC加1000 ml無菌水）、DEPC處理水（DEPC水經(jīng)濕熱高溫滅菌后的水）。將上述的金屬制品和研磨棒、研缽先用0.5mol/L NaOH沖洗干凈后放入DEPC水中浸泡過夜，用錫箔紙包住，以180°高溫滅菌4 h，即完成準(zhǔn)備工作。

二、取樣

從植物取50mg-80mg樣品，快速用DEPC處理水清洗表面，將滅菌后的剪刀和鑷子將樣品剪成小塊加鋼珠裝入RNase free的圓底EP管中，放入液氮罐中以-80°保存預(yù)冷。

三、提取

首先介紹的是試劑盒法，試劑盒法是一種由專業(yè)試劑生產(chǎn)公司生產(chǎn)出來裝有一整套RNA提取試劑的試劑盒子，有擎科、天根、TAKALA等眾多牌子試劑盒，優(yōu)點(diǎn)是簡單快捷方便，對(duì)于小白來說易上手，缺點(diǎn)是成本高，此外試劑盒法主要針對(duì)大眾樣品，對(duì)于一些特殊樣品效果可能一般。

從液氮罐中取出將裝有樣品的EP管放入已經(jīng)預(yù)冷好的研磨儀中，快速研磨，如果用的是研缽，需要加入液氮充分研磨，研磨時(shí)間不能超過1分鐘，樣品磨成粉末后，按照試劑盒說明書添加試劑，即可完成RNA提取，用試劑盒提取，2小時(shí)即可完成一批RNA提取工作。

其次介紹的是Trizol法，Trizol主要物質(zhì)是異硫氰酸胍，它可以破壞細(xì)胞使RNA釋放出來的同時(shí)，保護(hù)RNA的完整性Trizol試劑操作上的允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品，Trizol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染，缺點(diǎn)是需要自己配置試劑，比較繁瑣。

試劑：TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇、75% 乙醇（DEPC H₂ O 配制）、DEPC H₂O

提取步驟：

（1）組織樣品按100mg加入1ml Trizol。另外，組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會(huì)不好。 

（2）加Trizol后，室溫放置5min，使其充分裂解。

（3）4℃，12,000rpm 離心10 min，取上清。

（4）按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3 min。（氯仿為有機(jī)溶劑，有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進(jìn)入水相）

（5）4℃ 12,000rpm離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。

（6）得到的水相溶液加入等體積異丙醇混勻，室溫放置10 min。

（7）4℃ 12,000rpm離心10min，棄上清，RNA沉于管底，成膠狀沉淀。

（8）按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。

（9）4℃ 10000rpm離心5min，盡量棄上清。

（10）室溫晾干或真空干燥5-10min。注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解?？捎?0ul DEPC H ₂ O反復(fù)吹打溶解RNA樣品。

四、質(zhì)量檢測：

提取出來的RNA需要進(jìn)行質(zhì)量濃度檢測，以判斷是否得到高質(zhì)量的RNA，檢測方式有兩種，一種是電泳檢測，一種是紫外分光光度計(jì)法。

（1）電泳檢測法：分別取5 μL RNA 樣品 加上1 μL 1xloadingBuffer上樣緩沖液，在1%普通瓊脂糖凝膠上電泳，電壓 90 V，電泳 30 min 后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察RNA 帶型。

一般高純度的植物 RNA 電泳圖譜中有 28S rRNA和18S rRNA兩條特征性條帶，28S rRNA 和 18S rRNA 條帶內(nèi)側(cè)、條帶上方和條帶下方幾乎沒有彌散現(xiàn)象，且28S rRNA 條帶寬度和亮度是18S rRNA 條帶 2倍左右，兩條條帶明亮且一致，則表明提取的RNA沒有降解，保持了完整性。 

（2）紫外分光光度計(jì)法：根據(jù)核酸具有紫外吸收特征，還可選用超微量紫外分光光度計(jì)法測定波長在230nm、260nm 及280nm 下的光密度值，并計(jì)算 OD₂₆₀/ OD₂₈₀ 及 OD₂₆₀/OD₂₃₀ 的比值和RNA濃度。通常RNA濃 度需要≥100 ng/μL，OD₂₆₀/ OD₂₈₀比值在 1.8～2.0 范圍之間，表明所提 RNA 質(zhì)量較高，28S rRNA 和 18S rRNA 條帶沒有發(fā)生 明顯降解， 若 OD₂₆₀/ OD₂₈₀ 比值低于1.8 則說明存在蛋白質(zhì)污染；而 OD₂₆₀/ OD₂₃₀ 比值通常在 2.0～2.4 之間，表明所提 RNA 純度較高，但對(duì)于植物 RNA 而言， 若 OD₂₆₀/ OD₂₃₀ 比值低于2.0，則表明RNA有其他物質(zhì)干擾，質(zhì)量不純。

五、保存

提取出來的RNA通常會(huì)有微量的RNase出現(xiàn)，隨著時(shí)間的延長，會(huì)讓RNA逐漸降解，因此需要盡快進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，如果試驗(yàn)未能及時(shí)進(jìn)行，需要將RNA放入液氮中冷藏保存。

注意事項(xiàng)：

RNA提取是否成功的關(guān)鍵是RNase內(nèi)外源性污染

1.在RNase外源性污染控制上，一是需要做到操作上需要經(jīng)常更換手套，并且最好在超凈臺(tái)上操作；二是實(shí)驗(yàn)人員佩戴口罩，減少人員流動(dòng)；三是自配試劑都必須用DEPC水配置，以防治外源性RNase污染。

2.在RNase內(nèi)源性污染控制上，一是樣品研磨需要-80℃預(yù)冷且快速研磨；二是要取適量的植物材料進(jìn)行研磨，材料少會(huì)使 RNA 濃度低，材料多容易造成自身的 RNAse 過多而導(dǎo)致 mRNA 的降解， 還可能使材料研磨的不夠充分，進(jìn)而后續(xù)與溶液反應(yīng)不徹底；三是所用的試劑都必須經(jīng)過預(yù)冷；四是全程低溫離心。

總結(jié)：

RNA的好壞直接影響分子分析的后續(xù)試驗(yàn)，高質(zhì)量的RNA是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序、RT-PCR等試驗(yàn)的基礎(chǔ)，只要我們細(xì)心處理好每一個(gè)步驟，盡量減少污染，就能夠提取出高質(zhì)量的RNA。