圖片來(lái)源：https://www.mygenefood.com/crispr-cas9-introduction-genome-editing/
簡(jiǎn)介
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）——規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)和CRISPR-associated protein 9（Cas9），共同組成了一套系統(tǒng)，是細(xì)菌用來(lái)防御噬菌體DNA注入和質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的天然防御系統(tǒng)。但現(xiàn)在被人類(lèi)所重新利用，構(gòu)建了很強(qiáng)的RNA引導(dǎo)的DNA靶向平臺(tái)——主要用來(lái)基因組編輯、轉(zhuǎn)錄擾亂、表觀遺傳調(diào)控等。
細(xì)菌抵抗噬菌體入侵
圖中是細(xì)菌天然免疫系統(tǒng)。我們可以看到，CRISPR locus是由幾個(gè)原件構(gòu)成。一開(kāi)始是個(gè)反向轉(zhuǎn)錄的RNA，是特異的非編碼RNA，可以和重復(fù)序列部分互補(bǔ)（trancrRNA，橙色矩形），后面是各種cas基因（箭頭表示），接著是CRISPR排列（棕色的菱形是重復(fù)序列，彩色的是間隔）。而這些間隔序列是細(xì)菌從噬菌體DNA中獲得的遺傳原件：當(dāng)噬菌體感染細(xì)菌，細(xì)菌激活相關(guān)的cas基因——Cas1，Cas2,和Csn2，將其中新的間隔序列整合到自身的CRISPR arry中。一旦獲得以后，新的spacer就會(huì)出現(xiàn)在pre-crRNA中，此時(shí)tracrRNA與不同的SPACER互補(bǔ)，在RNaseIII的作用下，產(chǎn)生crRNA，進(jìn)一步在其他未知的核酸酶的作用，剪切crRNA的5'端，使得引導(dǎo)序列長(zhǎng)為20nt。如果噬菌體注入DNA，那么這個(gè)免疫系統(tǒng)將被激活，來(lái)干擾噬菌體DNA。
防御過(guò)程
剪切與修復(fù)
我們目前主要使用II型CRISPR系統(tǒng)，它和他的區(qū)別在于，只是需要一個(gè)DNA內(nèi)切酶Cas9來(lái)對(duì)與sgRNA20個(gè)互補(bǔ)堿基的帶有PAM結(jié)構(gòu)的DNA進(jìn)行剪切。剪切后是DNA產(chǎn)生平末端的DSB（雙鏈斷裂），然后在進(jìn)行非同源的末端連接過(guò)程中，容易隨機(jī)插入或者刪除或者替換?；蛘哌M(jìn)行高保真的同源定向修復(fù)，修復(fù)DNA。
Type II Cas9
Cas9剪切及突變產(chǎn)生
Cas9蛋白構(gòu)象重組
這里的例子是化膿鏈球菌的SpyCas9，是一個(gè)含有1368個(gè)氨基酸的多結(jié)構(gòu)和多功能的DNA核酸內(nèi)切酶。它的切割位點(diǎn)在PAM上游的第三個(gè)堿基，通過(guò)HNH（sgRAN互補(bǔ)的目標(biāo)序列）和RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域（非目標(biāo)序列）。要識(shí)別特定序列并進(jìn)行剪切，sgRNA與Cas9組合成一個(gè)復(fù)合體，其中sgRNAy與Cas9結(jié)合起著關(guān)鍵的作用，能夠使得Cas9構(gòu)象重構(gòu)，變得具有活性。crRNA前20堿基使得Cas9具有靶序列特異性，tracrRNA來(lái)招募Cas9蛋白。在這個(gè)系統(tǒng)中，有一個(gè)所謂的種子序列，20堿基spacer的3'端10-12個(gè)核苷酸。在種子序列的錯(cuò)配以及本身同源性都會(huì)嚴(yán)重影響系統(tǒng)特異性和脫靶效率。*
sgNRA
目標(biāo)DNA搜索與識(shí)別
PAM序列非常的關(guān)鍵，能夠起到識(shí)別自身和外來(lái)的序列。有實(shí)驗(yàn)表明，如果PAM進(jìn)行但突變，那么就能夠讓噬菌體入侵宿主。在sgRNA互補(bǔ)之前，首先是尋找PAM序列，如果沒(méi)有合適的PAM，那么通過(guò)蛋白三維結(jié)構(gòu)的坍塌，會(huì)離開(kāi)DNA，直到找到合適的PAM。一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解鏈，RNA進(jìn)入，與DNA互補(bǔ)，形成RNA-DNA結(jié)構(gòu)。sg種子區(qū)域序列與靶DNA的完美互補(bǔ)是很重要的。
CRISPR–Cas9介導(dǎo)的DNA靶定于剪切模型
首先，guide RNA的結(jié)合，使得Cas9從一個(gè)未激活的構(gòu)象變成具有DNA識(shí)別能力的構(gòu)象。RNA種子序列先形成A型構(gòu)象，為了目標(biāo)結(jié)合和鏈入侵，PAM識(shí)別位點(diǎn)預(yù)先形成用來(lái)PAM識(shí)別。然后，Cas9結(jié)合到PAM序列，使得酶能夠去識(shí)別附近的潛在的DNA靶序列。一旦Cas9在PAM附近找到了潛在的靶序列，會(huì)開(kāi)始解雙螺旋并繼續(xù)檢查剩余的靶序列。磷酸鎖環(huán)穩(wěn)定解旋的目標(biāo)DNA，且第一個(gè)堿基開(kāi)始翻轉(zhuǎn)向上，與guide RNA堿基配對(duì)。而Cas9繼續(xù)與非靶鏈上的翻轉(zhuǎn)堿基作用，促進(jìn)雙螺旋解開(kāi)。接著，堿基配對(duì)伴隨著Cas9構(gòu)象改變，促進(jìn)種子序列前面的guide RNA從限制中釋放出來(lái)，也形成配對(duì)，這個(gè)過(guò)程促使Cas9構(gòu)象持續(xù)變化，直到到達(dá)有活性的狀態(tài)。最終，guide RNA與目標(biāo)DNA完全互補(bǔ)使得HNH具有穩(wěn)定的，具有活性的構(gòu)象，來(lái)剪切目標(biāo)鏈DNA。與此同時(shí)，引起更大的構(gòu)象變化，使得非目標(biāo)鏈DNA進(jìn)入RuvC催化中心被剪切，這種轉(zhuǎn)態(tài)下，Cas9中牢牢結(jié)合在靶點(diǎn)序列上，直到其他的細(xì)胞因子過(guò)來(lái)替代它。
剪切示意圖
讀了這篇review，進(jìn)行一定程度的總結(jié)，有些地方還是有些不太清楚。
Fuguo Jiang and Jennifer A. Doudna, CRISPR–Cas9 Structures and Mechanisms, Annual Review of Biophysics 2017 46:1, 505-529
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