本文就CRISPR基因編輯的關(guān)鍵步驟和問(wèn)題進(jìn)行深入探討，探索高效的解決方法，希望助廣大CRISPR領(lǐng)域研究者一臂之力。
1．CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制
CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要包括兩個(gè)元件：Cas9核酸內(nèi)切酶和向?qū)NA。早先發(fā)現(xiàn)的guideRNA由tracRNA和crRNA兩部分組成, 兩部分融合表達(dá)后，即sgRNA，能夠識(shí)別靶DNA序列中保守的前間區(qū)序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motifs，PAM），sgRNA通過(guò)與Cas9蛋白結(jié)合，引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶定點(diǎn)切割靶向DNA。
圖1. CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制
如果sgRNA與基因組上其它位置（非靶序列）結(jié)合，便會(huì)引起脫靶效應(yīng)，如何設(shè)計(jì)高效、特異性的sgRNA成為科學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。針對(duì)此，設(shè)計(jì)高效特異性sgRNA和選擇合適的CRISPR核酸內(nèi)切酶是目前降低CRISPR脫靶效應(yīng)的兩個(gè)主要方向。
2.如何降低脫靶效應(yīng)
高效特異性sgRNA的設(shè)計(jì)：
（1） 對(duì)于sgRNA的長(zhǎng)度，一般應(yīng)為20 nt左右；
（2） 對(duì)于sgRNA序列的堿基組成，同時(shí)sgRNA種子序列盡量避免以4個(gè)以上的T結(jié)尾，GC%含量最佳為40%~60%；
（3） sgRNA的種子序列與非靶位點(diǎn)的匹配數(shù)盡可能低
（4） 如果構(gòu)建U6或T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的表達(dá)載體，需考慮sgRNA的5' 堿基為G或GG，以提高其轉(zhuǎn)錄效率；
（5） 對(duì)于sgRNA靶向基因的結(jié)合位置，如需造成基因移碼突變，需盡量靠近基因編碼區(qū)的ATG下游，最好位于第一或第二外顯子；
（6） 檢查sgRNA靶向結(jié)合位點(diǎn)基因組序列是否存在SNPs或者InDels；
（7） 如采用Cas9n，設(shè)計(jì)paired-sgRNA需考慮成對(duì)sgRNA的間距；
（8） 全基因脫靶效應(yīng)分析，需考慮脫靶位點(diǎn)最大允許的錯(cuò)配堿基數(shù)，建議最少5個(gè)堿基。重點(diǎn)考察種子序列和非種子序列堿基錯(cuò)配數(shù)，以及脫靶位點(diǎn)是否位于基因編碼區(qū)等，另外還可考察是否存在堿基插入或缺失的脫靶位點(diǎn)
為了保證CRISPR的成功率，首先針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)合成特異性的3-7個(gè)sgRNA序列，將sgRNA插入相應(yīng)載體并制備高質(zhì)量質(zhì)粒，然后對(duì)構(gòu)建好的sgRNA載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后提取基因組，用T7E1酶切法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)編輯效率驗(yàn)證，最后采用TA克隆和測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測(cè)序方法進(jìn)行細(xì)胞株篩選，這樣就可以保證至少有20個(gè)陽(yáng)性克隆結(jié)果。
除了設(shè)計(jì)高效且特異性的sgRNA外，選擇合適的CRISPR核酸內(nèi)切酶也是降低脫靶發(fā)生率的重要因素之一，目前科研人員最常用的CRISPR工具酶載體主要有四種：SpCas9，SpCas9n，SaCas9和Cpf1。
其中，SpCas9因可裝入多達(dá)7個(gè)sgRNA非常適用于科研領(lǐng)域；突變后的SpCas9n脫靶效率遠(yuǎn)低于SpCas9，常被用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；SaCas9由于遠(yuǎn)比SpCas9蛋白小，常被用于病毒包裝研究；Cpf1可裝4個(gè)sgRNA，切割雙鏈DNA成粘性末端，遠(yuǎn)低于Cas9的脫靶率，適用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。因此，針對(duì)特定的科研方案，需要選擇對(duì)應(yīng)的高效工具酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3．如何進(jìn)行細(xì)胞株高效篩選
在進(jìn)行目的基因編輯時(shí)，對(duì)基因敲除單克隆細(xì)胞株篩選一般采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法即隨機(jī)抽樣檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)；首先挑選一些克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行次級(jí)篩選，然后挑克隆測(cè)序，根據(jù)結(jié)果再次篩選，最終得到基因敲除單克隆細(xì)胞株。但是，傳統(tǒng)的挑斑篩選的統(tǒng)計(jì)方法，通量較小，不適于大量的克隆快速篩選研究方案，而且隨機(jī)的人為取樣會(huì)影響編輯效率數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，同時(shí)存在漏挑的可能性，進(jìn)而影響整體實(shí)驗(yàn)周期。
如何從大量的細(xì)胞中快速篩選得到基因敲除單克隆細(xì)胞株一直是一個(gè)難題，為了解決這一難題，金唯智自主研發(fā)GeneEditing-NGS-Genotyping技術(shù)，利用NGS測(cè)序技術(shù)可大規(guī)模對(duì)突變細(xì)胞株進(jìn)行篩選，并通過(guò)測(cè)序Reads定量檢測(cè)特定克隆的突變率以及突變類(lèi)型，可在短時(shí)間內(nèi)篩選出特定突變類(lèi)型的陽(yáng)性克隆。
首先,我們分別對(duì)96孔板中的細(xì)胞進(jìn)行基因組抽提，然后加barcode操作混合成sample pool建庫(kù)測(cè)序。測(cè)序下機(jī)后，獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾去接頭、去污染、質(zhì)控合格后與靶序列比對(duì)。統(tǒng)計(jì)出靶區(qū)域InDels，通過(guò)分析InDels所造成的突變類(lèi)型，最終在短時(shí)間內(nèi)篩選出特定突變的陽(yáng)性克隆。
相比于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序方法，該技術(shù)具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)：短時(shí)高效，為我們的科研工作者節(jié)約寶貴時(shí)間；分析全面，準(zhǔn)確度高，確保每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確無(wú)誤；可同時(shí)針對(duì)多個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行篩選，省去繁瑣的重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作；自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)流程可以極大的避免了人工操作的誤差；嚴(yán)格的質(zhì)控體系和專(zhuān)業(yè)的技術(shù)分析團(tuán)隊(duì)可保證數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠。
4．全方位脫靶分析
作為常規(guī)的科研工具，這一被稱(chēng)為“魔剪”的基因編輯工具在基因治療應(yīng)用方面也被寄予厚望。但是，困擾其它定向核酸酶的老問(wèn)題——脫靶效應(yīng)，也同樣影響著CRISPR系統(tǒng)。研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR會(huì)帶來(lái)大量的非靶序列的SNVs和InDels，這些突變涉及了基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。重要基因的關(guān)鍵堿基突變有可能會(huì)直接影響機(jī)體的生理功能，如果CRISPR系統(tǒng)引入非靶序列的大量突變，這將大大影響對(duì)CRISPR的臨床應(yīng)用。
在臨床轉(zhuǎn)化中，使用準(zhǔn)確尋找脫靶位點(diǎn)的方法有重要意義。目前，主要是通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)sgRNA脫靶位點(diǎn)，但正如文章所提到的，預(yù)測(cè)的脫靶位置并未發(fā)生基因突變，而未預(yù)測(cè)到的脫靶位點(diǎn)卻發(fā)生了大量突變，說(shuō)明目前預(yù)測(cè)的脫靶的算法存在一定的局限性，由此看來(lái)，我們需要在全基因組水平上評(píng)估脫靶效應(yīng)造成的影響。基于此，金唯智推出CRISPR-高深度（50X）全基因組重測(cè)序，該方法能全方位精準(zhǔn)地對(duì)基因編輯的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行off-target檢測(cè)。
高深度的全基因組測(cè)序?qū)τ跈z測(cè)由CRISPR脫靶引起InDels將更為準(zhǔn)確。如圖4所示：下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)控得到clean reads，與參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)單核苷酸變異(SNV) 、插入/缺失（InDels）位點(diǎn)數(shù)量及位置信息，從而在全基因組范圍評(píng)估CRISPR off target效應(yīng)。同時(shí)，我們還可以對(duì)SNVs和InDels位點(diǎn)進(jìn)行基因功能注釋。
5. 總結(jié)
正如大家熱切討論的，CRISPR基因編輯技術(shù)正處于爆發(fā)式的進(jìn)展中，未來(lái)的應(yīng)用必將涉及生命科學(xué)和臨床轉(zhuǎn)化等各個(gè)領(lǐng)域，和我們的生活密切相關(guān)?；蚝铣珊透咄繙y(cè)序?qū)⒅RISPR基因編輯技術(shù)更快速更精準(zhǔn)。首先，設(shè)計(jì)高效特異sgRNA和選擇合適的CRISPR核酸內(nèi)切酶在實(shí)驗(yàn)前期減少脫靶效應(yīng)，然后采用GeneEditing-NGS-Genotyping方法進(jìn)行單克隆細(xì)胞株篩選大大提高通量縮短周期，最后，通過(guò)高深度（50X）全基因組重測(cè)序在全基因組范圍內(nèi)精準(zhǔn)地對(duì)基因編輯的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行脫靶檢測(cè)，多重把關(guān)多重設(shè)計(jì)讓實(shí)驗(yàn)進(jìn)程更快更精準(zhǔn)。以上為我們對(duì)CRISPR基因編輯技術(shù)的一些見(jiàn)解，希望能拋磚引玉引起大家廣泛的討論。
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