米勒 路易斯* (Louis H. Miller*) 和蘇新專 (Xin-zhuan Su)

美國國立衛(wèi)生研究院過敏與傳染病研究所，瘧疾與媒介研究室

美國馬里蘭州 (20852)，羅克維爾市

*通訊聯(lián)絡(luò)人： 米勒 路易斯 (Louis H. Miller)
NIAID/NIH/Twinbrook III, 12735 Twinbrook Parkway, Room 3E-32D, Rockville, MD 20852 USA
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摘要

今年的拉斯克－狄貝基臨床醫(yī)學(xué)研究獎 (Lasker DeBakey Clinical Medical Research Award) 授予了中國科學(xué)家屠呦呦，以表彰她在青蒿素 (artemisinin) 的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用于治療瘧疾方面所做出的杰出貢獻(xiàn)。這一醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的重大發(fā)現(xiàn)，每年在全世界, 尤其在發(fā)展中國家, 挽救了數(shù)以百萬計瘧疾患者的生命。

在基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，許多重大發(fā)現(xiàn)的價值和效益并不在短期內(nèi)顯而易見。但也有少數(shù)，它們的誕生對人類健康的改善所起的作用和意義是立竿見影的。由屠呦呦和她的同事們一起研發(fā)的抗瘧藥物青蒿素就是這樣的一個例子。從上個世紀(jì)90年代末以來，青蒿素作為治療瘧疾的一線藥物挽救了無數(shù)的生命，其中大部分是生活在全球最貧困地區(qū)的兒童。

“523項目”帶來的希望

或許不可思議的是，青蒿素的故事原來始于中國文化大革命和援越抗美戰(zhàn)爭時期。當(dāng)年在越南戰(zhàn)爭的戰(zhàn)場上，由于瘧疾的流行，作戰(zhàn)雙方的士兵紛紛感染瘧疾，嚴(yán)重地影響了部隊?wèi)?zhàn)斗力?？孤揉膼盒辕懺x (Plasmodium falciparum) 的出現(xiàn)更成為當(dāng)時瘧疾防治的主要難題，這也促使了作戰(zhàn)雙方政府在新抗瘧藥物的研發(fā)上的大量投入。美方的努力促成了甲氟喹 (mefloquine) 的發(fā)現(xiàn)。數(shù)據(jù)顯示，使用單劑量的甲氟喹就能治愈感染氯喹抗性瘧原蟲的患者 (Trenholme et al., 1975)。然而，由于當(dāng)時的北越政府缺乏相應(yīng)的研究機(jī)構(gòu)和科研條件，他們只能轉(zhuǎn)而求助于中國。

1967年5月23日，在毛澤東主席和周恩來總理的指示下，來自全國各地的科研人員聚集北京就瘧疾防治藥物和抗藥性研究工作召開了一個協(xié)作會議；一項具有國家機(jī)密性質(zhì)、代號為“523項目”的計劃就此啟動了。該項目組織了來自~60多個研究機(jī)構(gòu)和單位的500多名研究人員參與 (張劍方等. 2006)。項目短期的目標(biāo)是要盡快研制出能在戰(zhàn)場上有效控制瘧疾的藥物 (到1969年已確立三種防治方案) ，而它的長遠(yuǎn)目標(biāo)是通過篩選合成化合物和中草藥藥方與民間療法來研發(fā)出新的抗瘧藥物。

由于“523項目”具有軍事機(jī)密的性質(zhì)，項目的研究結(jié)果是不允許向外公布的。在“文革”時期，發(fā)表科學(xué)論文也是不可能的。這種種原因?qū)е逻@項工作當(dāng)時并不被523項目以外的人所知, 但課題的研究信息與進(jìn)展還是以報告的形式在研究人員的內(nèi)部會議上進(jìn)行了自由地交流。

沒有文獻(xiàn),沒有出版記錄，到底誰才是發(fā)現(xiàn)青蒿素的主要貢獻(xiàn)者呢？當(dāng)我們 (Miller與蘇) 于2007年著手探究青蒿素研發(fā)的歷史時，我們對問題的答案還一無所知。 經(jīng)過深入的調(diào)查研究, 我們毫無疑問地得出結(jié)論：中國中醫(yī)科學(xué)院北京中藥研究所的屠呦呦教授是發(fā)現(xiàn)青蒿素的首要貢獻(xiàn)者。1969年1月，屠呦呦被任命為北京中藥研究所523課題組的組長,領(lǐng)導(dǎo)對傳統(tǒng)中醫(yī)藥文獻(xiàn)和配方的搜尋與整理。1981年10月，屠呦呦在北京代表523項目首次向到訪的世界衛(wèi)生組織研究人員匯報了青蒿素治療瘧疾的成果 (Tu, 1981)。

從古代藥方到現(xiàn)代藥物

在調(diào)查和收集過程中，屠呦呦和她的課題組成員篩選了2000余個中草藥方并整理出了640種抗瘧藥方集。他們以鼠瘧原蟲為模型檢測了200多種中草藥方和380多個中草藥提取物。在研究中他們發(fā)現(xiàn)青蒿提取物 (一種菊科艾屬植物，學(xué)名為Artemisia annua L.) 對鼠瘧原蟲的抑制率可達(dá)68%。但是后續(xù)的實驗結(jié)果卻顯示，青蒿提取物對鼠瘧原蟲的抑制率只有12-40%。對此屠教授認(rèn)為，低抑制率可能是由于提取物中有效成份濃度過低的原因造成的。于是他們著手對提取方法進(jìn)行改進(jìn)。通過翻閱古代文獻(xiàn)，特別是東晉名醫(yī)葛洪 (公元283-343年) 的著作《肘后備急方》中的“青蒿一握，以水二升漬，絞取汁，盡服之”,她意識到常用煎熬和高溫提取的方法可能破壞了青蒿有效成份。不出所料，改用乙醚低溫提取后, 研究人員如愿獲得了抗瘧效果更好的青蒿提取物。

可是，這樣得到的青蒿提取物仍具毒性和副作用。針對這個情況,屠教授進(jìn)一步去除了青蒿提取物中不具抗瘧效果的酸性部分但保留了毒性低抗瘧力改善的中性部分。在1971年10月進(jìn)行的鼠瘧測試實驗中他們發(fā)現(xiàn)，這種中性的青蒿提取物 (編號191#) 對鼠瘧原蟲的抑制率達(dá)100%。1972年3月8日在南京召開的523會議上，屠呦呦報告了這一結(jié)果。屠教授在會議上提供的一些關(guān)鍵的提煉參數(shù)也加速了提純青蒿晶體的進(jìn)程。在接下來的幾個月里，盡管屠呦呦的研究團(tuán)隊在獲得高質(zhì)量的青蒿晶體上遇到了一些挫折,另外兩個團(tuán)隊 (云南藥物研究所的羅澤淵和山東省中醫(yī)藥研究所的魏振興等) 通過使用屠呦呦提供的信息和提取方法,很快就從當(dāng)?shù)氐狞S花蒿A. annua L. (譯者注：A. annua L是叫黃花蒿或青蒿還有爭論) 中提煉出了具有良好的抗鼠瘧原蟲效果的純青蒿晶體。在廣州中醫(yī)藥大學(xué)的李國橋小組主持的臨床實驗中, 云南藥物研究所提取的青蒿素展示了極好的抗瘧療效。

有趣的是，與此相關(guān)青蒿素的X-衍射晶體結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)、以及青蒿素抗非重癥瘧和抗重癥腦型瘧的學(xué)術(shù)論文里卻只有青蒿研究協(xié)作組的署名而沒有個人的名字 (1979)。該論文闡明了青蒿素是一種帶有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯，結(jié)構(gòu)中的過氧基團(tuán)與青蒿素的抗瘧活性有關(guān) (圖1)。1985年，美國沃爾特-里德陸軍研究所 (Walter Reed Army Institute of Research, WRAIR) 的Klayman從生長于波托馬克河 (Potomac River) 河岸的青蒿A. annua中分離出一種與青蒿素相同的化合物。Klayman在研究中發(fā)現(xiàn)，植物體中只有極少的天然成份含過氧基團(tuán)。盡管WRAIR的研究人員對大量的羥基過氧化物進(jìn)行了測驗，但并未發(fā)現(xiàn)具有抗瘧活性的物質(zhì) (Klayman, 1985)。

由廣州中醫(yī)藥大學(xué)李國橋教授領(lǐng)導(dǎo)的兩項臨床研究對青蒿素和甲氟喹進(jìn)行了比較。在此研究中，他們首次建議為了防止瘧疾的復(fù)發(fā)和抗藥性瘧原蟲的產(chǎn)生，應(yīng)考慮復(fù)方藥物療法 (Jiang et al., 1982; Li et al., 1984)。與甲氟喹相比較，青蒿素具有高效、速效的特點，能在數(shù)小時內(nèi)清除寄生蟲。但是青蒿素的藥效半衰期短，為獲得更好的治療效果，應(yīng)與另外一種藥物組成復(fù)方進(jìn)行用藥。接受青蒿素單方治療的病人一般能很快恢復(fù)，但是如果病人過早停藥，往往會導(dǎo)致瘧疾癥狀的復(fù)發(fā)。這種非完全治愈的情形可能引起抗藥性瘧原蟲的產(chǎn)生。李國橋的研究團(tuán)隊也開發(fā)出一種用于治療腦型瘧的含青蒿素的栓劑，目前這種栓劑已在非洲地區(qū)的臨床上使用。栓劑的使用縮短了治療周期并提高了存活率。

獲知中國人發(fā)現(xiàn)了青蒿素之后，Nick White (一位在泰國工作的英國牛津大學(xué)教授) 也開始對青蒿素及衍生物進(jìn)行研究。他證實了青蒿素及其衍生物具有抗瘧速效的特點，并不遺余力地倡導(dǎo)青蒿素及其衍生物與另外一種伴侶藥物組合給藥以徹底清除瘧原蟲。 目前這種青蒿素復(fù)方已成為世界上治療瘧疾的標(biāo)準(zhǔn)療法。由于他在這些方面的重要貢獻(xiàn)， Nick White于2010年獲得了加拿大蓋爾德納獎 (Canada Gairdner Award)。 除了青蒿素的發(fā)現(xiàn)，“523項目” 還研制出了多種可以與青蒿素組合的藥物，其中包括苯芴醇 (lumefantrine), 哌喹 (piperaquine), 和雙喹哌 (pyronaridine) 等。“523項目”的成功反映了其特有的，集眾多的研究單位和科研工作者之長的大協(xié)作精神。

與抗藥性的不懈斗爭

一個重要卻還無法回答的問題是青蒿素或青蒿素衍生物的藥效在未來還能保持多久？也許我們能從其它抗瘧藥物的歷史得到一些啟示。在前一種天然藥物奎寧 (quinine) 的引入之前，瘧疾在全球是一種死亡率極高的疾病?？鼘幍氖褂醚杆俳档土巳祟惢集懠驳乃劳雎省Ｔ谝獯罄?，奎寧價格的下降導(dǎo)致奎寧使用量的增加，進(jìn)而使得患者死亡率急劇下降。而當(dāng)惡性瘧原蟲對合成的抗瘧藥氯喹 (chloroquine) 產(chǎn)生抗性后，小孩患瘧死亡率迅速升高的情形也就不足為奇了。在氯喹抗性被鑒定出是由于位于瘧原蟲的PfCRT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因的突變引起之后 (Fidock et al., 2000) ，這些突變也被闡明其實并非源于非洲、而是從東南亞引入非洲的 (Wooton et al., 2002)。

非洲國家與地區(qū)的公共衛(wèi)生組織目前遇到的一個主要棘手的問題是對何時改變瘧疾治療策略作決定。因為可選擇的療法有限，在決定改變療法之前需要對其功效進(jìn)行一番周密的評估。然而，在改變療法的過程中患者的死亡 (尤其是兒童) ，常常會在新療法引入之前發(fā)生。磺胺-乙胺嘧啶 (sulfadoxine-pyrimethamine，商品名為：凡西達(dá)Fansidar) 是在氯喹之后引入非洲地區(qū)的一種抗瘧組合藥。在其使用后不久，便有大量的報道指出惡性瘧原蟲對凡西達(dá)產(chǎn)生了抗性。研究顯示，凡西達(dá)抗性的發(fā)生是因為瘧原蟲二氫葉酸還原酶編碼基因和二氫喋酸合成酶編碼基因的突變引起的。同樣，甲氟喹作為單一的抗瘧藥引入亞洲后也產(chǎn)生了抗藥性。不幸的是，甲氟喹抗性瘧原蟲的產(chǎn)生也削弱了Fansimef (一種由凡西達(dá)和甲氟喹組合的復(fù)方藥) 的藥效。另外，由于甲氟喹的造價昂貴，這種藥并不適合在非洲地區(qū)使用。

堅持使用青蒿素類復(fù)方藥至少在一段時間內(nèi)能阻止青蒿素抗藥性的發(fā)生 (圖1)。為了保護(hù)青蒿素的功效,我們需要謹(jǐn)慎地評估伴侶藥物的療效。我們希望這些青蒿素復(fù)方能長期有效，以減少因療法的更替而帶來的死亡。

另一個要面臨的問題是一旦產(chǎn)生青蒿素抗性，接下來我們將采用什么藥物？ 有證據(jù)稱，與以往的報道或泰國其它地區(qū)的情況相比較，柬泰邊境地區(qū)的臨床治療過程中瘧原蟲被清除的周期正在延長, 可能顯示對青蒿素及衍生藥物的抗性正在柬泰邊界悄然發(fā)生 (Dondorf et al., 2009)。然而，體外和體內(nèi)試驗顯示，使用和以往相同劑量的青蒿素均能殺滅所謂的‘抗性’瘧原蟲。 盡管人們在青蒿素抗性的問題上還存在著爭議，謹(jǐn)慎的做法是假定它是抗藥性發(fā)生的早期并設(shè)法去限制這些‘抗性’瘧原蟲的傳播。在某種程度上,這也映射出與其它藥物如氯喹抗性和磺胺-乙胺嘧啶的早期抗性相似的流行病發(fā)展模式。 這二者的抗性都起源于東南亞、而后傳播至非洲地區(qū)。因為瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和傳播極其迅速，我們一定要提高警惕。從這個角度奎寧其實是個特例。在使用奎寧的百余年里，治愈所需奎寧劑量的增加的幅度 (耐藥性上升幅度) 還是相對緩慢的。我們希望這種情況也能發(fā)生在其他中草藥如青蒿素上。

抗瘧治療的未來

基于青蒿素的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，研究人員也正努力研制其它的抗瘧化合物。我們已經(jīng)知道青蒿素的抗瘧活性與血紅蛋白的消化和血紅素鐵的釋放有關(guān)； 它們最終誘導(dǎo)蟲體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng) (Klonis et al., 2011)。正如Klayman1985年所指出的，只有極少的天然產(chǎn)物含過氧基團(tuán)，這種過氧化物也為我們在研發(fā)新抗瘧藥上提供了一個契機(jī) (Charman et al., 2011)。

但是誰將去開發(fā)這些新的藥物？雖然青蒿素的發(fā)現(xiàn)源于戰(zhàn)爭；我們希望未來會有更加和平的動力去驅(qū)動抗瘧新藥的研發(fā)。然而，長期以來，瘧疾都不被制藥商所關(guān)注。 制藥商們更愿意將資源和精力投放到富庶國度里有利可圖的疾病上。為填補(bǔ)這一欠缺 ，像Medicines for Malaria Venture (MMV) 等公私合資的組織或許能給我們提供一個藥物研發(fā)的成功典范。高通量大規(guī)模篩選化合物等現(xiàn)代化手段也可能帶給我們新的抗瘧藥。

另外一個與疾病治療和防治密切相關(guān)的問題是對于降低死亡率的效果有多大？在全球許多地區(qū),青蒿素復(fù)方療法和經(jīng)菊酯類殺蟲劑處理的蚊帳幾乎是同時應(yīng)用于來控制瘧疾。這些措施已經(jīng)降低了非洲許多地區(qū)的瘧疾發(fā)病率,但仔細(xì)的數(shù)據(jù)分析的結(jié)果仍然令我們無法推斷究竟是哪一種措施導(dǎo)致了瘧疾患病率以及相應(yīng)的死亡率的降低 (O’Meara et al., 2010)。令人不安的是在非洲，近年蚊媒對菊酯類殺蟲劑的抗性有明顯上升的趨勢 (Ranson et al., 2011)。在塞內(nèi)加爾的Dielmo村莊，一條源于地下泉水的小溪流經(jīng)這村莊導(dǎo)致了瘧疾感染一直保持在一個較高的水平。對這個地區(qū)的一項研究指出, 當(dāng)?shù)氐寞懠不疾÷孰m然在采取防治措施后有了顯著降低，最近卻有回升的跡象 (Trape et al., 2011) .這個現(xiàn)象有可能與耐藥性蚊媒的出現(xiàn)有關(guān)。 一旦耐藥性蚊媒廣泛擴(kuò)散和蔓延，加上因為瘧疾疫情的減少導(dǎo)致人群保護(hù)性免疫力的下降，人們就只能完全依賴于青蒿素復(fù)方療法來進(jìn)行防治。只要傳播瘧原蟲的蚊媒仍在非洲地區(qū)滋生，瘧疾就有可能復(fù)燃。

盡管戰(zhàn)勝瘧疾的任務(wù)仍然很艱巨，屠呦呦和她中國的同事們發(fā)現(xiàn)的青蒿素給我們帶來了希望。青蒿素的發(fā)現(xiàn)不愧是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)史上的一項偉大的成就。

致謝

在文稿和文中插圖的起草期間Susan Pierce博士 (LIG, NIAID) 和Thomas E. Wellems博士 (LMVR, NIAID) 提出了一些寶貴的意見；廈門大學(xué)的李劍博士及Cancer Cell的楊曉虹博士在英譯中過程中提供了大力協(xié)助；插圖由Alan Hoofring繪制；在此一并向他們表示感謝！本項工作得到了美國國立衛(wèi)生研究院 (NIH) 過敏與傳染病研究所 (NIAID) 所內(nèi)研究計劃項目的資助。

摻考文獻(xiàn)

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• 張劍方等 (2006) 《遲到的報告——五二三項目與青蒿素研發(fā)紀(jì)實》。 羊城出版社， 廣州 510085. ISBN 7-80651-539-9.,

?	圖1. 抗瘧藥青蒿素 自屠呦呦和她的同事從中草藥植物青蒿 (Artemisia annua L) 中發(fā)現(xiàn)了青蒿素 (artemisinin) 之后，人們已合成許多青蒿素衍生物，其中包括活性比青蒿素更好的雙氫青蒿素 (dihydroartemisinin)。為了保護(hù)這一重要的抗瘧藥，將青蒿素與另外一種藥物組成的復(fù)方療法是當(dāng)今唯一推廣使用的治療方案。根據(jù)青蒿素的抗瘧活性有賴于它的過氧橋這一特點，在未來我們也許能合成出更多新的抗瘧藥。