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文章信息

題目：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer
時間：2021年5月
期刊：Nature Medicine(IF: 36)
DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-021-01323-8

總覽

免疫檢查點阻斷（ICB）聯(lián)合新輔助化療可改善乳腺癌（BC）的病理完全反應(yīng)，本文研究為什么只有一部分腫瘤對 ICB 有反應(yīng)。激素受體陽性或三陰性乳腺癌患者在手術(shù)前接受了抗 PD1 治療，作者對接受抗 PD1 治療的初治患者（n = 29）或抗 PD1 治療前接受新輔助化療的患者（n = 11）的治療前與治療中活檢樣本進行單細胞轉(zhuǎn)錄組、T 細胞受體和蛋白質(zhì)組分析。結(jié)果表明三分之一的腫瘤含有表達 PD1 的 T 細胞；無論腫瘤亞型如何，這些 T 細胞在抗 PD1 治療后都會克隆擴增，擴增主要涉及具有明顯細胞毒活性（PRF1、GZMB）、免疫細胞歸巢（CXCL13）和耗竭標志物（HAVCR2、LAG3）的 CD8+ T 細胞，以及以 T-helper-1 表達為特征的 CD4+ T 細胞（IFNG)和濾泡輔助 (BCL6, CXCR5) 標志物。在治療前活檢中，免疫調(diào)節(jié)樹突細胞 (PD-L1+)、特定巨噬細胞表型 (CCR2+ 或 MMP9+) 和表現(xiàn)出主要組織相容性復(fù)合體 I/II 類表達的癌細胞的相對頻率與 T 細胞擴增呈正相關(guān)。相反，未分化的前效應(yīng)/記憶 T 細胞TCF7+、GZMK+）或抑制性巨噬細胞（CX3CR1+、C3+）與 T 細胞擴增呈負相關(guān)。總的來說，作者的數(shù)據(jù)確定了與抗 PD1 治療后 T 細胞擴增呈正相關(guān)或負相關(guān)的各種免疫表型和相關(guān)基因組。闡明了乳腺癌中抗 PD1 治療反應(yīng)的異質(zhì)性。

樣本信息

第一組（初治早期BC）的 29 名患者和第二組（接受新輔助化療的 BC）的 11 名患者。

單細胞測序技術(shù)

scRNA-seq(10x Genomics)  , scTCR-seq和CITE-seq

部分分析結(jié)果

抗 PD1 治療前和治療期間的單細胞分析

由scRNA-seq從第一組患者隊列中獲取了29對治療前和治療期間的高質(zhì)量活檢數(shù)據(jù)，涉及175,942個細胞，平均每個細胞檢測到1,759個基因。隨后的分析確定了分群：惡性乳腺上皮細胞、免疫細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞（如上圖）。

使用scTCR-seq方法，在51499個T細胞中定義了基于共享TCR序列的克隆型，共確定了9例在治療前與治療期間在兩個閾值（>2或>5）上的克隆型擴張患者（如下圖）

表達PD1的T細胞在抗PD1治療后擴增

作者分析了T細胞擴增(E vs NE)和治療(治療前vs治療期間)分層的scRNA-seq數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過治療后，NEs中成纖維細胞較多，Es中T細胞較多（如圖d）。在治療期間，癌細胞和成纖維細胞在NEs中更常見，而T細胞在Es中進一步富集。

作者通過對T細胞進行亞聚類（如圖e），發(fā)現(xiàn)一個CD8 +及CD4 +細胞簇表達PD1（如圖f），表示免疫檢查點標志物（LAG3, HAVCR2, PDCD1）、效應(yīng)(IFNG, NKG7)標志物和細胞毒性標志物 (GZMB, PRF1) 都表達的具有耗竭樣的活化T細胞。作者將這種細胞稱為經(jīng)驗T細胞（TEX細胞）。

擬時序分析結(jié)果

三種不同的CD8+ T細胞軌跡。TN連接到TEM細胞，TEM細胞分叉成三種不同的軌跡，形成TEX1和TEX2細胞、滯留記憶CD8+ T細胞(TRM)和激活效應(yīng)/記憶T細胞(TEMRA細胞)。

在CD4+ T細胞(TREG除外)中，發(fā)現(xiàn)了額外的表型異質(zhì)性。經(jīng)驗豐富的TEX細胞分裂為1型輔助細胞(TH1)和濾泡輔助細胞(TFH)

T細胞擴增過程中基因表達的變化

作者沿著 CD8+ TEX 軌跡確定了五組差異表達基因 (DEG)。由初始 T 細胞標記物（CCR7、LEF1）組成的第一組沿著軌跡下降，而兩組由（早期）激活基因（GZMK、GZMM、GZMA、NKG7）組成，在軌跡中途增加，但隨后下降。另外兩組在軌跡結(jié)束時增加，并以效應(yīng)子（IFNG）、細胞毒性（GZMB、PRF1）、早期和全身衰竭（PDCD1、CTLA4、ENTPD1；圖 a）標記為特征。在每個基因組中，作者鑒定了幾個以前未被鑒定為 T 細胞標記的基因（例如，INPP5F 和 GPR25 作為分化的 TEX 標記，圖 a）。盡管軌跡將具有相似表達的細胞分配到相同的擬時序，但作者觀察到一些基因在 E 和 NE 軌跡之間差異表達。例如，效應(yīng)子和細胞毒活性相關(guān)基因（PRF1、GZMB、IFNG）、CTLA4 和 TOX2 在 Es 中始終較高（圖 b）。RUNX3 及其輔因子 CBFB，它們在 NE 中減少（圖 b）。通路分析揭示了干擾素（IFN）反應(yīng)的上調(diào)和 Es 中氧化磷酸化的下調(diào)（圖c、d）。沿著 CD4+ TH1 軌跡，作者在比較 Es 與 NE時類似地確定了五個基因集（圖e）和 499 個 DEG，包括潛在的 TH1 標記，如 ZEB2（圖f）。與 CD8+ T 細胞類似，NEs 中 RUNX3 和 CBFB 減少，而 Es 中 IFN-α/γ 反應(yīng)增加（圖 f-h）。因此，沿著軌跡的基因表達譜確定了在 Es 和 NEs 之間差異表達或激活的標記或途徑。

這篇文章圖很多很長，有興趣的同學(xué)可以自己去看看。

總結(jié)

這篇文章評估了接受ICB的乳腺癌患者的腫瘤內(nèi)變化。分析的是來自配對的治療前（接受抗PD1治療的29名初診患者）和治療期間（抗PD1治療前接受新輔助化療的11名患者）的單細胞轉(zhuǎn)錄組、T細胞受體和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)三分之一的腫瘤含有表達PD1的T細胞，不論腫瘤亞型如何，抗PD1治療后T細胞可克隆擴張?？偟膩碚f，文章的數(shù)據(jù)確定了各種免疫表型和相關(guān)基因集，它們與抗PD1治療后的T細胞擴張呈正相關(guān)或負相關(guān)，揭示了乳腺癌中抗PD1治療反應(yīng)的異質(zhì)性。