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小小的microRNA（miRNA）在近年來受到了越來越多的關(guān)注，因為它們能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達。此外，由于miRNA相對穩(wěn)定，并且可以在各種生物體液中發(fā)現(xiàn)，這些小分子也成為許多疾病的生物標志物，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病。

miRNA通常是利用RT-qPCR和芯片來研究的，但西北大學NUSeq核心實驗室的主任Xinkun Wang指出，這些技術(shù)只能分析已知的miRNA種類，不能探索新東西。“有了miRNA測序（miRNA-Seq），你就可以發(fā)現(xiàn)一些新東西?！?/p>

盡管miRNA的測序在本質(zhì)上與其他RNA相同，但樣本處理時的一些步驟卻是不同的。這篇文章將介紹一些最新的方法，幫助你高效制備miRNA-Seq的文庫。

QIAGEN NGS產(chǎn)品開發(fā)的副主管Jonathan Shaffer認為，目前的文庫制備和PCR技術(shù)已經(jīng)相當好，不需要特別富集小RNA（smRNA）。最關(guān)鍵的要求是RNA制備要干凈，且沒有肝素（這是一種相當強的RT抑制劑）。

需要注意的是，在提取RNA時應(yīng)保留小RNA。加州大學戴維斯分校的Lutz Froenicke表示，修改標準的RNA提取方案，采用更高濃度的鹽沉淀，可以確保小RNA被回收。對于那些傾向于試劑盒的研究人員，他建議使用Zymo Research的產(chǎn)品，因為它們“價格便宜效果好”。如果起始量低，他建議使用Norgen Biotek的試劑盒。

mRNA的文庫制備通常是從片段化開始的，然后通過隨機引物法來產(chǎn)生cDNA。不過，miRNA非常小，也就不需要片段化?！叭绻闶褂秒S機引物，那么合成將從分子中間的某個地方開始，漏掉了大約10個堿基，”Froenicke解釋說。因此，miRNA的文庫制備是直接在RNA上連接3’和5’接頭，同時創(chuàng)建模板，讓引物可以結(jié)合。

然而，這種接頭連接的策略也帶來了一些棘手問題。3’和5’接頭可能彼此連接，形成二聚體。二聚體過多的話則占據(jù)了寶貴的測序資源，使得較低豐度的物種無法測序，甚至造成整個運行損失。Takara Bio USA的科學家Marta Gonzalez-Hernandez表示：“儀器需要一個非常多樣化的文庫，以確保它們能夠區(qū)分各個簇，并為你提供正確的序列，而接頭二聚體始終是相同的序列?！?/p>

人們意識到這個問題，并采用一些策略來防止或去除引物二聚體。最顯而易見的方法就是大小選擇（size selection），這也可以作為純化步驟來去除其他污染。大小選擇至少可通過三種方式完成?？的螤柎髮W的副教授Praveen Sethupathy認為，凝膠電泳再加上手動切膠是傳統(tǒng)的方法，但“相當費力，特別是在制備大量樣本時”。

Sage Science的Pippin Prep自動化DNA大小選擇系統(tǒng)“效果非常好，但成本至少是兩萬美元” ，因此你只能在一些核心實驗室見到它，F(xiàn)roenicke談道。第三種方法是基于磁珠的選擇。這種方法的分辨率不大足以區(qū)分接頭二聚體和帶插入片段的文庫，但快速方便，因此一些試劑盒會推薦。

一些試劑盒則另辟蹊徑，阻止接頭二聚體的形成。有的在添加5’接頭之前，去除過量的3’接頭。有的則利用化學修飾的接頭，阻斷二聚體的形成。比如QIAGEN的QIAseq miRNA Library Kit，它利用修飾寡核苷酸的專利方法幾乎避免了測序文庫中接頭二聚體的存在，有效去除了測序過程中經(jīng)常觀察到的主要污染物。

另外一個選擇是一開始不連接接頭。Takara和Diagenode的試劑盒是利用聚腺苷酸化、逆轉(zhuǎn)錄、模板轉(zhuǎn)換以及PCR的組合來創(chuàng)建帶有條形碼接頭的RNA-Seq文庫。這些策略旨在減少接頭連接的偏倚，這個問題已逐漸被人們意識到。

另一種減少偏倚的方法就是像Bioo Scientific的NEXTflex? Small RNA Sequencing Kit那樣，使用接頭庫。這些接頭或多或少帶有相同的序列，但在末端的連接發(fā)生處使用隨機的堿基。據(jù)介紹，這個試劑盒所產(chǎn)生的文庫與qPCR的相關(guān)性非常好。

QIAGEN的試劑盒則整合了特異性分子條形碼（UMI）。區(qū)別于傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析方法，通過對于測序結(jié)果中分析條形碼種類而非數(shù)量的統(tǒng)計，避免了擴增過程中因擴增效率而引入的偏倚，讓miRNA-Seq定量分析的靈敏度可媲美qPCR。

當然，研究人員感興趣的也許不止是miRNA。目前已發(fā)現(xiàn)有其他種類的小分子RNA，也發(fā)揮重要的生物學作用。在研究這些小RNA時，你首先需要了解試劑盒的原理是否與感興趣的RNA相匹配。比如，許多小RNA帶有修飾堿基或保護帽，這就為連接操作帶來了一些挑戰(zhàn)。不過，相信這可難不倒你們。