說明：文章1800字，老師可以從第5條起讀；學(xué)生從第1條讀起

                              單克隆抗體制備

1、抗原制備

用于制備單克隆抗體的抗原純度越高，單抗制備實(shí)驗(yàn)的成功率越高。一般來說，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重組蛋白）、多肽、小分子等。

2、免疫動物

2.1免疫動物的選擇

通常，根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠或大鼠作為免疫動物。因?yàn)?/span>，所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來源于 LOU/c 大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。就小鼠而言，一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠。

2.2制定免疫方案

設(shè)計(jì)免疫程序時，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、 免疫次數(shù)與間隔時間等。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射等。免疫次數(shù)一般是3次（鏈接高中知識：多次注射疫苗的意義？）。間隔時間因抗原不同而不同，間隔1天到1月不等。動物的免疫一般在融合前前兩個月，根據(jù)確定的免疫方案開始對動物進(jìn)行初次免疫。動物的免疫通常共有三次，一般來說，在最后一次加強(qiáng)免疫后第 3 天取脾（鏈接高中知識：免疫器官）進(jìn)行融合較適宜。由不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此在注射抗原的同時，常常會加入佐劑，以增強(qiáng)抗原的抗原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

3、制備雜交瘤細(xì)胞前的準(zhǔn)備工作

3.1準(zhǔn)備 脾淋巴細(xì)胞

已經(jīng)免疫的 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠），在無菌條件下去除脾臟，并完成脾淋巴細(xì)胞的制備。

注1：如何制備單細(xì)胞懸液，以備后面的細(xì)胞融合？（鏈接高中知識：細(xì)胞懸液制備）

注意：制備脾淋巴細(xì)胞過程中，通常也會進(jìn)行小鼠眼球摘除采血的的操作，將血清分離后作為抗體檢測時陽性對照血清（鏈接高中知識：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對照思想）。

3.2 準(zhǔn)備 骨髓瘤細(xì)胞制備（略）

3.3 準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞（鏈接高中知識：克隆培養(yǎng)法）

在組織培養(yǎng)中，單個或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長繁殖，若加入其它細(xì)胞，則可使這些細(xì)胞生長繁殖，這種加入的細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時單個或少數(shù)分散的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入飼養(yǎng)細(xì)胞使之繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞，高中教材中用的是小鼠成纖維細(xì)胞。

為了得到所需的雜交瘤細(xì)胞，必須利用 HAT 培養(yǎng)基對融合后的細(xì)胞進(jìn)行篩選。HAT 培養(yǎng)基的篩選原理為：DNA合成途徑有生物合成途徑與應(yīng)急合成途徑兩種，HAT 培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A） 和胸腺嘧啶核苷酸（T）等物質(zhì)，氨基喋呤可以對 DNA 的生物合成途徑進(jìn)行阻斷，骨髓瘤細(xì)胞會因?yàn)樯锖铣赏緩奖蛔钄嗲易陨砣狈?yīng)急合成途徑導(dǎo)致不能增殖進(jìn)而快速的死亡；而 B 淋巴細(xì)胞因缺乏體外增殖的能力，一般在 10 天左右死亡；雜交瘤細(xì)胞具有體外增殖能力且由于次黃嘌呤與胸腺嘧啶核苷酸的存在，可以通過應(yīng)急途徑合成DNA 并在 HAT 培養(yǎng)基中正常生長，不會死亡。因此將融合后的細(xì)胞放于 HAT 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其他的融合結(jié)果會 全部死亡，最終篩選出雜交瘤細(xì)胞

5、雜交瘤細(xì)胞的克隆化

原因3長期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞（見下圖），復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應(yīng)作克隆化，以檢測抗體分泌情況。

6、大規(guī)模獲得單克隆抗體

6.1 體外培養(yǎng)

6.2 體內(nèi)培養(yǎng)

7、 雜交瘤技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：與傳統(tǒng)的免疫動物方法制備抗體相比，利用雜交瘤技術(shù)可以制備出高純度的單抗，并且可以進(jìn)行單克隆抗體的大量生產(chǎn)。

缺點(diǎn)：a.操作步驟繁瑣；b.利用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)出的單克隆抗體多為鼠源性，而鼠源性抗體在應(yīng)用中有諸多問題，例如被人類免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體( HAMA）反應(yīng)、在人體循環(huán)系統(tǒng)中很快被清除等。（避免缺點(diǎn)，研制嵌合體抗體，詳解等待公眾號更新.....）

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