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MSI和MMR的定義
微衛(wèi)星( microsatellite，MS) 是指細(xì)胞基因組中以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(多為1 ~6個(gè)) 為單位串聯(lián)重復(fù)的DNA 序列，又稱短串聯(lián)重復(fù)(STR) 。MSI 分成3 類: 微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MSI-H) 、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定性(MSI-L) 、微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS) [1]。
人類細(xì)胞DNA在復(fù)制過程中可能整合錯誤的核苷酸，但隨即會被選擇性地從新生DNA 鏈中移除，從而防止子代細(xì)胞出現(xiàn)基因突變，這種機(jī)理稱為錯配修復(fù)MMR。MMR的產(chǎn)物是錯配修復(fù)蛋白，如MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2等。他們形成異質(zhì)二聚體，識別錯配堿基和不匹配DNA環(huán)（IDLs），準(zhǔn)確定位于細(xì)胞核，體現(xiàn)其錯配修復(fù)功能。
圖1 錯配修復(fù)功能復(fù)合體示意圖
錯配修復(fù)蛋白家族具有一些基本特征，由兩個(gè)錯配修復(fù)功能的復(fù)合體構(gòu)成。MLH1（紅）和PMS2（藍(lán)）是一個(gè)復(fù)合體；MSH2（紅）和MSH6（藍(lán)）是一個(gè)復(fù)合體，其中MLH1和MSH2是兩個(gè)復(fù)合體內(nèi)的主要功能蛋白。復(fù)合體內(nèi)主要蛋白的降解往往伴隨著各自復(fù)合體內(nèi)其他蛋白的共同丟失。MSH6與MSH3之間存在功能冗余，有時(shí)MSH6的功能會被MSH3代償?shù)?。在變異類型上?/span>MSH2多發(fā)生剪切突變，導(dǎo)致蛋白水平的丟失。而MLH1的啟動子容易發(fā)生超甲基化，同時(shí)伴有點(diǎn)突變發(fā)生。
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MSI/MMR的臨床意義
MSI 是MMR 蛋白功能缺陷導(dǎo)致的結(jié)果。MMR蛋白功能缺陷同時(shí)也會導(dǎo)致基因組呈現(xiàn)高突變表型，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。目前，MSI和(或) MMR蛋白檢測被美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN) 結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南及中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO) 結(jié)直腸癌診療指南推薦用于所有結(jié)腸直腸癌(CRC) 患者[2-4]。MSI 檢測對于包括CRC 和子宮內(nèi)膜癌(EC) 在內(nèi)的多種實(shí)體瘤患者均具有重要臨床意義。
林奇綜合征主要由MMR 基因( MLH1、MSH2、MSH6 或PMS2) 之一發(fā)生雜合性致病性胚系突變所致，或由EPCAM 基因缺失導(dǎo)致MSH2 不表達(dá)所致[5]。由于MMR 基因的功能失活性改變，林奇綜合征患者往往表現(xiàn)錯配修復(fù)功能缺陷(dMMR) 和(或)MSI-H 表型。
需要注意的是，以MMR 蛋白/MSI 檢測作為初篩手段，有可能漏診部分林奇綜合征患者。MMR 蛋白表達(dá)及MSI (基于不同的微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇的DNA檢測) 對林奇綜合征的檢測敏感度分別為83% 和77% ～ 89%，提示即使對所有CRC 患者進(jìn)行MMR或MSI 普篩，也可能存在高達(dá)10% 的漏診率[6]。
目前公認(rèn)dMMR/MSI-H 是Ⅱ期CRC 的獨(dú)立良好預(yù)后因子，對于具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ期CRC 患者，3/4 級分化(低分化) 不被認(rèn)為是高危因素[7]。與MSS患者相比，MSI-H患者死亡風(fēng)險(xiǎn)降低35% [4]。
一項(xiàng)基于多個(gè)Ⅲ期臨床研究入組患者數(shù)據(jù)( n = 570) 的回顧性分析表明，Ⅱ/Ⅲ期CRC 患者存在MSI-H 可預(yù)測其接受5-FU 單藥輔助化療無效[8]。一項(xiàng)meta 分析亦顯示，具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ/Ⅲ期CRC 患者不能從5-FU 單藥輔助化療獲益，且Ⅱ期dMMR/MSI-H 患者接受5-FU 單藥輔助化療生存期反而縮短( HR = 2. 95; 95% CI: 1. 02～ 8. 54) [9]。這些數(shù)據(jù)表明，對于具有dMMR/MSI-H表型的Ⅱ期CRC 患者，給予5-FU 單藥輔助化療非但不能生存獲益，反而對長期生存產(chǎn)生不利影響。
(A) 未經(jīng)治療的不同MMR表型CRC患者的生存期(B) 經(jīng)治療的不同MMR表型CRC患者的生存期.
圖2 dMMR/MSI-H Ⅱ/Ⅲ期CRC患者接受5-FU 單藥輔助化療生存期
因此，Ⅱ期CRC 患者根治術(shù)后是否應(yīng)接受輔助化療以及應(yīng)接受何種藥物或方案進(jìn)行化療，需要綜合考慮臨床-病理高危因素以及MSI 狀態(tài)。國內(nèi)外權(quán)威指南均明確提出，具有dMMR/MSI-H 表型的Ⅱ期CRC 患者預(yù)后較好，不建議使用氟尿嘧啶類單藥輔助治療[2-4]。
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MSI和MMR的檢測方法及其對比
3.1 IHC 法檢測MMR 蛋白
IHC 方法采用分別針對MLH1、MSH2、MSH6 及PMS2 的特異性抗體，陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核。如腫瘤樣本中4 個(gè)MMR 蛋白均陽性表達(dá)，則為錯配修復(fù)功能完整 (pMMR) ; 任一MMR 蛋白缺失即為dMMR[11]。
3.2 多重?zé)晒釶CR毛細(xì)管電泳法
直接檢測MSI 狀態(tài)的常用方法是多重?zé)晒?/span>PCR 毛細(xì)管電泳法，這也是當(dāng)前公認(rèn)的MSI 檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”?！?/span>CSCO 結(jié)直腸癌診療指南2020 版》建議采用NCI 推薦的5 個(gè)MS 位點(diǎn)( BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346 和D17S250 ) 進(jìn)行MSI 檢測[4]。《NCCN遺傳/家族高危評估指南:結(jié)直腸癌》建議MSI檢測Panel可選擇NCI/Bethesda版，也可選擇Promega版： BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27和2個(gè)五核苷酸位點(diǎn)(用于標(biāo)本鑒定) [12]。
3.3 二代測序(NGS )
近年來，隨著高通量測序平臺的廣泛應(yīng)用，NGS平臺目標(biāo)區(qū)域測序(即NGS panel) 或全外顯子組測序(WES) /全基因組測序(WGS) 開始應(yīng)用于MSI檢測。NCCN 結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南指出，MSI 檢測可通過經(jīng)驗(yàn)證的NGS panel 進(jìn)行，尤其是對于那些需要同時(shí)檢測RAS /BRAF 突變狀態(tài)的轉(zhuǎn)移性CRC 患者[2-3]。
此外，基于外周血循環(huán)腫瘤DNA (ctDNA) 的MSI(b-MSI) -NGS 算法亦已嶄露頭角，為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期實(shí)體瘤患者MSI 檢測提供新選擇。由于血檢NGS panel 及其各自b-MSI-NGS 算法數(shù)據(jù)尚未在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表，因此，b-MSI-NGS 檢測在當(dāng)前不應(yīng)常規(guī)推薦，僅作為缺乏組織的患者為明確MSI 狀態(tài)的一種替代手段。
3.4 不同檢測方法的比較
表1 不同檢測方法學(xué)比較
注: MMR: 錯配修復(fù); MSI: 微衛(wèi)星不穩(wěn)定; b-MSI: 基于外周血循環(huán)腫瘤DNA 的MSI; IHC: 免疫組織化學(xué);
NGS: 二代測序; ctDNA: 外周血循環(huán)腫瘤DNA ; AFmax: 最大等位基因頻率; TMB: 腫瘤突變負(fù)荷
IHC、PCR與NGS 三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。IHC 法可以直接鑒定出導(dǎo)致MSI-H 發(fā)生的MMR 缺陷基因。IHC 法檢測MMR 蛋白表達(dá)可在多數(shù)醫(yī)院的病理科完成，普及性強(qiáng)，且價(jià)格低廉。但該方法受判讀人員的主觀影響較大，存在一定的假陽性與假陰性?；跇颖疚⑶懈畹亩嘀?zé)晒?/span>PCR 毛細(xì)管電泳法，簡便且便宜，敏感度和特異度均較好(特別是在經(jīng)廣泛驗(yàn)證的CRC 腫瘤樣本中)，但全國能開展該項(xiàng)檢測的病理科相對較少，且存在一定的假陰性。對于需要同時(shí)檢測腫瘤驅(qū)動基因和(或) 治療相關(guān)基因變異的患者，目標(biāo)區(qū)域NGS 是個(gè)不錯的選擇。NGS 法可同時(shí)檢測panel 覆蓋的驅(qū)動基因變異，包括MMR 基因胚系和(或) 體細(xì)胞突變，甚至TMB 等分子標(biāo)簽?；?/span>ctDNA 樣本的b-MSI 檢測目前正處于驗(yàn)證階段，有望為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期腫瘤患者提供新的選擇。但NGS 單獨(dú)用于MSI 檢測則不推薦，理由是增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和浪費(fèi)資源。
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MSI和MMR的相關(guān)性
一般而言，dMMR 相當(dāng)于MSI-H 表型，pMMR 相當(dāng)于MSI-L /MSS 表型。大量的臨床試驗(yàn)證實(shí)，分子水平的MSI檢測與蛋白水平MMR檢測具有高度關(guān)聯(lián)性，其中在結(jié)直腸癌兩者的一致性約為92%，在子宮內(nèi)膜癌兩者的一致性是高達(dá)94%[12-14]。
圖3 MSI與MMR檢測具有高度關(guān)聯(lián)性
然而，在實(shí)際的臨床工作中，大概有5%-10%的患者發(fā)生MMR與MSI檢測不一致的情況，主要有以下兩種類型。
dMMR vs MSS
5%-10%的dMMR患者并未導(dǎo)致MSI的出現(xiàn)，就是dMMR和MSS，其發(fā)生的原因可能為：
①某些MMR蛋白的缺失，被功能代償，如前文所述MSH6蛋白被MSH3蛋白功能代償。
②MLH1啟動子甲基化導(dǎo)致的腫瘤異質(zhì)性，從而影響結(jié)果判斷。
pMMR vs MSI-H
5%-10%的MSI的發(fā)生并未伴隨dMMR的出現(xiàn)，就是pMMR和MSI-H，其發(fā)生的原因可能為：
①某些MMR蛋白發(fā)生錯義突變，損失了MMR功能，但仍存在相應(yīng)抗原被抗體檢測識別。因此，在檢測MMR的過程中，其并未發(fā)生缺失，還是可以被檢測出，實(shí)際上功能已經(jīng)喪失，而發(fā)生MSI的情況。
②由四種基因以外的其他基因引起的MSI，如POLE/POLD。
對于MSI/MMR雙平臺檢測，兩者具有互補(bǔ)作用。在對免疫治療的提示中，以MSI的檢測狀態(tài)為主要標(biāo)準(zhǔn)。在組織量足夠的情況下應(yīng)使用雙平臺檢測；當(dāng)雙平臺檢測結(jié)果不一致時(shí)，并且排除實(shí)驗(yàn)因素的情況下，可用NGS平臺復(fù)檢，提供更多確診信息。
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