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實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）是一項以 PCR 反應為基礎的 DNA 定量技術，通過對目標基因在擴增過程中產(chǎn)生的拷貝數(shù)進行實時的定量，從而達到對目的基因的定性和定量分析。常用的對 PCR 產(chǎn)物進行熒光定量檢測的方法有兩種：一種是利用熒光染料與雙鏈 DNA 結合，通過熒光強度進行定量；另一種是利用攜帶了熒光報告基團的特異DNA 探針對目標基因進行定量。一、利用熒光染料進行定量一種最為常用的定量方法就是在 PCR 反應體系中加入熒光染料，此類熒光染料會與所有的雙鏈 DNA 結合，并產(chǎn)生熒光。游離的熒光分子不會產(chǎn)生熒光信號，只有與雙鏈 DNA 結合的熒光分子才會釋放熒光，隨著 DNA 拷貝數(shù)的增加，測得的熒光強度也會增強。利用熒光染料進行定量的優(yōu)勢就是成本低廉，只需要一對普通的引物就能完成定量。然而，常用的諸如 SYBR Green 染料會與所有的雙鏈 DNA 無差別地結合，包括引物二聚體， 因此有可能會導致對目標基因的定量不精確，靈敏度偏低。二、利用熒光探針進行定量熒光探針只能檢測出與自身序列互補的 DNA 片段，因此用探針法定量可以有效地避免引物二聚體的干擾，使定量結果更加精確。此外，通過使用攜帶不同熒光信號的多種探針， 我們可以同時對一個樣品中的多個靶序列進行定量。熒光探針的 5’端攜帶有一個熒光報告基團，3’端則為淬滅基團，在正常情況下兩個基團間的距離很近，淬滅基團會抑制報告基團使其無法發(fā)出熒光。在 PCR 反應過程中，引物和熒光探針在退火階段都會與目的片段結合；在延伸階段，Taq 酶因為具有 5’-3’核酸外切酶活性，會將探針，使得報告基團和淬滅基團相互分開，從而釋放出熒光。每增加一條目的基因的拷貝，就會有一個探針被切開并釋放熒光信號，因此隨著 PCR 反應的進行，熒光信號會逐漸增強。使用探針進行熒光定量的優(yōu)點就是精確度和靈敏度都要比熒光染料高，且可以做到同時對多個基因進行定量，但是相應的合成探針的成本也要比使用熒光染料高出許多。下面以細胞樣品為例詳細介紹了熒光定量PCR實驗所需材料、試劑、儀器以及完整的實驗步驟方法，供大家學習交流。實驗材料：細胞樣品實驗試劑：RNA提取試劑盒、熒光定量PCR Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆轉錄酶MMLV、異丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TE、MgCl2、瓊脂糖、溴化乙錠、MOPS、甲醛、乙酸鈉、EDTA、EB、溴酚蘭實驗儀器：離心管、離心機、風光光度計、電泳槽、凝膠板、Realtime PCR儀實驗步驟：1.樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。②兩相分離每 1ml 的 TRIZOL 試劑裂解的祥品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后 ，15℃到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。 RNA 全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。③RNA沉淀：將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀。其中的RNA,混勻后15℃到30℃孵育10分鐘后，千4℃下12000rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。④RNA清洗：移去上清液，每1ml TRIZ OL 試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇( 75%乙醇用 DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘．⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液 ，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA時 ，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解 ，獲得的 RNA 溶液保存于-80℃待用．2.RNA質量檢測1）紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。①濃度測定A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(mug/ml)計算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug②純度檢測RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定 ①制膠1g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10x MOPS電泳緩沖液濃度成分0.4 MMOPS，pH 7.00.1 M乙酸鈉0.01 MEDTA灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。②準備RNA樣品取3ug RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。③電泳上樣前凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。④紫外透射光下觀察并拍照28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結果。3.樣品cDNA合成①反應體系序號反應物劑量1逆轉錄buffer2 ul2上游引物0.2 ul3下游引物0.2 ul4dNTP0.1 ul5逆轉錄酶MMLV0.5 ul6DEPC5 ul7RNA模板2 ul8總體積10 ul輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。②混合液在加入逆轉錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 ul，37℃水浴60分鐘。③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。4.梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR①β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。②反應體系如下：標準品反應體系序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10 ul2陽性模板上游引物F0.5 ul3陽性模板下游引物R0.5 ul4dNTP0.5 ul5Taq酶1 ul6陽性模板DNA5 ul7ddH2O32.5 ul8總體積50 ul輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。管家基因反應體系：序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10 ul2內參照上游引物F0.5 ul3內參照下游引物R0.5 ul4dNTP0.5 ul5Taq酶1 ul6待測樣品cDNA5 ul7ddH2O32.5 ul8總體積50 ul輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。5.制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。②反應體系序號反應物劑量110xPCR緩沖液2.5 ul2MgCl2溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5 dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至總體積為25 ul輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）；72℃延伸5分鐘。③PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。④將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產(chǎn)物濃度為1x1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。6.待測樣品的待測基因實時定量PCR①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。②體系配置如下:序號反應物劑量1SYBR Green 1 染料10 ul2上游引物1 ul3下游引物1 ul4dNTP1 ul5Taq聚合酶2 ul6待測樣品cDNA5 ul7ddH2O30 ul8總體積為50 ul輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。③將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃ 2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。7.實時定量PCR使用引物列表引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(即錯配)。8.電泳各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。通常得到qPCR結果我們要怎樣進行統(tǒng)計分析呢？下面通過實例，針對不同的實驗目的從如何進行實驗設計到結果分析都將一步步為大家解答。實例：現(xiàn)需要檢測某一藥物對細胞培養(yǎng)液中p53 mRNA水平的影響。那么，從實驗設計到結果分析我們該如何做呢？實驗設計：種兩小皿細胞（3.5cm），其中一皿加藥，另一皿加對照。處理一段時間后，就可以收細胞提RNA,再進行反轉錄，接下來就可以做qPCR了（內參為GAPDH），需要做的qPCR孔如下：上面的p53和GAPDH都有三個PCR孔，這叫做PCR重復，其作用是為了消除本次實驗的操作誤差。同樣的，我們再重新種細胞，做qPCR實驗，如此重復三次，則稱為獨立重復實驗。而我們統(tǒng)計結果的時候需要統(tǒng)計的則是獨立重復實驗。實驗后，我們得到Ct值結果如下：Test1：加藥對照p5322.8922.822325.3225.425.3GAPDH15.2915.9115.6914.9815.3315.22Test2：加藥對照p5322.622.4622.8525.725.525.61GAPDH15.8315.7115.2715.4615.4515.22Test3：加藥對照p5322.4922.4922.625.6825.6425.61GAPDH14.8114.7915.3415.2514.615.29結果分析：加藥（Ct平均值）對照（Ct平均值）Test1Test2Test3Test1Test2Test3p5322.922.6422.5325.3125.625.6GAPDH15.6315.614.9815.1815.2815.05△Ct7.277.047.5510.1310.3210.552^-△Ct0.0064790.00760.005340.000890.000780.000670.0007805732^-△△Ct8.3003889.734996.836131.143281.002210.85452△Ct=Ct(p53)-Ct(GAPDH);注意，如何計算2^-△△Ct？首先我們把對照里面的2^-△Ct求平均（上表中為0.000780573），然后用2^-△Ct 中的每一個數(shù)據(jù)除以這個數(shù)據(jù)，對照組也同樣除。整理數(shù)據(jù)得：Test1Test2Test3平均值標準差加藥組p53相對值8.39.736.838.2866671.450046對照組p53相對值1.1410.850.9966670.145029