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開花時間是一個重要的農(nóng)藝性狀，有助于植物的適應(yīng)性。然而，辣椒開花時間的遺傳基礎(chǔ)尚未得到廣泛研究。為了了解開花時間背后的遺傳學(xué)，我們通過雜交一個自發(fā)的早開花突變體和晚開花辣椒系構(gòu)建了一個 F2種群。使用bulk segregant RNA-seq，將該種群中控制開花時間的主要基因座定位到染色體2的末端。在F2種群的297個個體中， APETALA2 ( AP2 )同源物( CaFFN )與開花時間共分離。父母之間的比較揭示了一個自然發(fā)生的稀有 SNP，導(dǎo)致在早期開花突變體中起始密碼子丟失CaFFN。具有高CaFFN表達(dá)的轉(zhuǎn)基因本氏煙草植物表現(xiàn)出開花時間延遲和花型缺陷。另一方面，CaFFN沉默的辣椒植物開花較早。因此，CaFFN基因在辣椒中充當(dāng)開花抑制因子。CaFFN 可作為轉(zhuǎn)錄激活因子激活CaAGL15和miR156e的表達(dá)，并作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制CaAG、CaAP1、CaSEP3、CaSOC1和miR172b的表達(dá)基于 qRT-PCR 分析。使用酵母單雜交和雙熒光素酶報告基因測定法檢測到 CaFFN 對CaAGL15的直接激活，這與 CaFFN 調(diào)節(jié)開花時間的假設(shè)一致。此外，CaFFN基因關(guān)聯(lián)分析揭示了與天然辣椒種群的開花時間顯著相關(guān)，表明CaFFN基因?qū)苯返拈_花時間具有廣泛的影響。最后，分析了CaFFN/AP2同源物的系統(tǒng)發(fā)育、進(jìn)化擴(kuò)展和表達(dá)模式，以提供對CaFFN的有價值的見解。這項研究增加了我們對CaFFN參與控制辣椒開花時間的理解，從而證明CaFFN是早熟辣椒育種的靶基因。

3.1 辣椒開花期性狀的遺傳分析

在我們的育種工作中發(fā)現(xiàn)了一種天然早熟變種，經(jīng)過多年的自交和選育，從中產(chǎn)生了穩(wěn)定的早花自交系B9431（圖1a）。B9431在主莖上長出一片葉子后即可開花。為了研究辣椒開花時間的遺傳，研究了由 B 9431和 A 145雜交培育的 F 2種群，包括 297 株植物。在這項研究中，開花時間是根據(jù)先前的研究通過計算子葉和第一朵花之間的主莖上的葉子數(shù)量（稱為 FFN 數(shù)量）來測量的16 – 18. 親本 B 9431的平均 FFN 數(shù)為 2.3（范圍為 1 至 4），親本 A145為 14（范圍為 13 至 15），F(xiàn) 1后代為 8.5（范圍為 8 至 10）；F2種群的分布范圍為2～14。F 2種群呈雙峰分布（圖1b）。根據(jù) F 2種群在低點（FFN 數(shù)量為 5）的分布，晚開花（FFN 數(shù)量從 6 到 14 不等）與早開花（FFN 數(shù)量從 2 到 4 不等）的比例辣椒約為 3:1 ，因此表明該性狀存在一個強(qiáng)主要基因。

3.2 BSR-Seq 確定了辣椒開花時間的主要基因座

選擇F 2種群中FFN 數(shù)量最少的30 株植物構(gòu)建“早花池”，選擇FFN 數(shù)量最多的30 株植物構(gòu)建“晚花池”。提取兩個池的總 RNA 用于 Illumina 高通量測序。為每個池計算由此檢測到的單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 的頻率。使用 3.0 Mb 滑動窗口跨 1.0 Mb 基因組間隔計算兩個池之間 SNP 頻率的平均差異，并將結(jié)果與參考基因組的所有 12 條染色體作圖（圖 1c）。該圖顯示了在 2 號染色體遠(yuǎn)端 SNP delta 值的明顯峰值，這表明該區(qū)域有一個控制開花時間的強(qiáng)主要基因座。

3.3 早花親本B9431起始密碼子點突變候選基因的鑒定

在 2 號染色體末端，編碼 AP2 轉(zhuǎn)錄因子的基因CA02g14540引起了我們的注意，因為它可能在擬南芥中的直系同源物AP2具有多種功能，包括參與花的轉(zhuǎn)變和發(fā)育。F2群體的兩個親本中該基因的序列是通過PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序來確定的。在早開花親本 B9431中發(fā)現(xiàn)了起始密碼子 ATG 的點突變（圖 2a）。該 SNP 導(dǎo)致 CaFFN 的原始起始密碼子丟失，并導(dǎo)致B 9431中CaFFN的推定移碼突變。為了研究該基因作為本研究中控制開花時間的候選基因的潛力， 開發(fā)了切割擴(kuò)增多態(tài)序列（CAPS）標(biāo)記CSF2（圖2b，補充表 S1 ) 。使用標(biāo)記 CSF2對 B9431 ?× A 145的 F 2群體中的 297 個個體進(jìn)行基因分型。結(jié)果表明，所有早花（FFN數(shù)量為2~4）植物與B 9431具有相同的基因型，所有晚開花（FFN數(shù)量為6至14）植物具有與A 145或F1 (圖 2b )，表明 CSF2 與開花時間共分離。這些結(jié)果表明CA02g14540是 F 2中開花時間的候選基因（稱為CaFFN基因）。

3.4 兩個表達(dá)CaFFN的轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出顯著的開花延遲

為了研究CaFFN是否可能在控制開花時間中起作用，產(chǎn)生了在 CaMV 35S 啟動子控制下表達(dá)辣椒CaFFN的轉(zhuǎn)基因本氏煙品系。然而，即使通過qRT-PCR檢測到CaFFN基因的表達(dá)，在32個轉(zhuǎn)基因品系中也沒有觀察到開花時間或花型的明顯變化。

CaFFN是一種AP2類基因，具有推定的保守miR172靶位點。因此推測miR172靶位點的修飾會增加CaFFN基因的表達(dá)。由于這個原因，產(chǎn)生了22個轉(zhuǎn)基因系，其用含有六個與miR172（miR172-抗性CaFFN突變體，35S::CaFFNm3 ）的同義突變的修飾的CaFFN cDNA轉(zhuǎn)化（圖2a）。其中，兩個轉(zhuǎn)基因品系（第10和16系）開花時間明顯延遲（圖3a）。

3.5 CaFFN基因的沉默促進(jìn)辣椒的早期開花

為了研究CaFFN在辣椒開花時間中的功能作用，對親本系A(chǔ)145進(jìn)行了功能缺失實驗，其中CaFFN被VIGS沉默。攜帶基于TRV的載體 TRV2:: CaFFN與攜帶 TRV1 載體的農(nóng)桿菌混合的農(nóng)桿菌在四葉期滲入辣椒幼苗。用含有 TRV2 :: PDS 和 TRV1 的農(nóng)桿菌的幼苗作為對照來測量基因沉默的影響。注入含有 TRV2 和 TRV1 的農(nóng)桿菌的幼苗被用作陰性對照。滲透的幼苗在 20 ± 1 °C 和 90 ± 5% 的相對濕度下生長，以提高沉默效率。注射 TRV2:: PDS的植物表現(xiàn)出光漂白（圖 4a ），表明辣椒 A145中的基因沉默成功。注射TRV2:: CaFFN的植物比對照植物開花早（圖4a）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照植物相比， TRV2 :: CaFFN植物中CaFFN的表達(dá)水平明顯下降（圖4b ）。CaFFN基因沉默導(dǎo)致TRV2:: CaFFN植物提前開花的結(jié)果進(jìn)一步顯示了CaFFN作為辣椒開花抑制因子的功能。

3.6 響應(yīng)CaFFN沉默的基因表達(dá)變化

本研究的上述結(jié)果表明CaFFN是開花抑制因子。然而， CaFFN引起的開花時間改變的機(jī)制仍有待確定。作為與AP2最接近的同源物，確定 AP2 周圍的網(wǎng)絡(luò)是否守恒并適用于CaFFN值得我們關(guān)注。為此，AG、AGL15、AP1、SEP3和SOC1的可能直系同源物(CaAG、CaAGL15 、CaAP1、CaSEP3和CaSOC1) 進(jìn)行搜索。這些開花時間和花器官發(fā)育基因的表達(dá)水平通過qRT-PCR相對于管家基因CaGAPDH進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，VIGS沉默的植物比對照CaFFN中CaAG、CaAP1、CaSEP3和CaSOC1的表達(dá)水平顯著升高。相比之下，CaFFN沉默植物中CaAGL15的表達(dá)水平顯著低于對照（圖4b）。相對于CaU6測定 microRNA 的表達(dá)水平。在CaFFN沉默的植物中，miR172b表現(xiàn)出增加的水平，而miR156e表現(xiàn)出降低的水平（圖 4b）。結(jié)果表明CaFFN作為轉(zhuǎn)錄激活因子促進(jìn)CaAGL15和miR156e表達(dá)的作用并作為轉(zhuǎn)錄抑制因子來抑制CaAG、CaAP1、CaSEP3、CaSOC1和miR172b的表達(dá)。

3.7 CaFFN 轉(zhuǎn)錄因子直接激活開花抑制基因CaAGL15

在CaFFN基因沉默的辣椒植物中，開花抑制基因CaAGL15的表達(dá)水平降低的發(fā)現(xiàn)促使我們檢查CaAGL15是否直接受 CaFFN 調(diào)節(jié)。我們使用酵母單雜交試驗檢查了 CaFFN 與 CaAGL15 的順式元件結(jié)合的能力。將CaFFN的全長 cDNA與 pGADT7 載體中的 GAL4 激活結(jié)構(gòu)域 (AD) 一起克隆。CaAGL15的順式元件被插入到 pAbAi 載體中。對于 CaAGL15 的誘餌菌株， aureobasidin A (AbA) 的最小抑制濃度為 400 ng/ml 。結(jié)果表明，CaFFN 直接與CaAGL15相互作用，因為用 pGADT7-CaFFN 轉(zhuǎn)化的酵母和誘餌載體在添加了最小抑制濃度 AbA 的 SD/-Leu 選擇培養(yǎng)基中生長，而用 pGADT7-lam 和作為陰性對照的 pAbAi-P53 轉(zhuǎn)化的酵母則沒有（圖. 4c ). 此外，在N中進(jìn)行了雙熒光素酶測定。本塞米亞納葉子。將含有CaAGL15 （報道分子）的啟動子區(qū)和與 CaFFN（效應(yīng)子）的融合蛋白的重組 pGREEN0800-CaAGL15 共滲入葉中。與對照相比，CaAGL15和 CaFFN 蛋白的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致兩倍的 LUC/REN 比率（圖 4d）。結(jié)果表明，CaFFN可以在體內(nèi)與CaAGL15啟動子結(jié)合，反式激活報告基因的表達(dá)。

3.8 辣椒中CaFFN/AP2同源物的表征

為系統(tǒng)分析辣椒中的AP2家族基因，以AP2結(jié)構(gòu)域（PF00847）的HMM譜為查詢，在栽培辣椒Zunla-1基因組數(shù)據(jù)庫中共獲得24個AP2家族基因（圖6）。為了探索辣椒中AP2家族擴(kuò)增的主要驅(qū)動力，通過 MCScanX 包檢測每個基因的重復(fù)類型，包括單例、分散、近端、串聯(lián)和全基因組重復(fù)/三倍 (WGD/T) 或分段重復(fù)（圖 6）。這表明WGD/T或節(jié)段重復(fù)是辣椒AP2家族基因擴(kuò)增的主要力量。其中，CaFFN（Capana02g003062) 基因位于一個包含 98 個基因的大共線區(qū)塊中。

為了比較CaFFN相關(guān)基因在辣椒、擬南芥和番茄中的表達(dá)模式，將這些基因在SAM中三個不同發(fā)育階段的表達(dá)模式繪制在熱圖中（圖6）。與CaFFN基因相似，除了Capana04g002188、Capana09g001880、Capana10g001776、Capana10g001789、Capana11g000645和TOE3之外，許多CaFFN相關(guān)基因在營養(yǎng)分生組織階段表達(dá)水平較高，在分生組織階段表達(dá)水平較低。

辣椒開花時間的控制是一個有吸引力的育種目標(biāo)，旨在創(chuàng)造適合當(dāng)?shù)氐钠贩N。據(jù)報道，在辣椒中，包括CaJ、CaBL、CaS、FA和CaAP2 14、15、19 – 21在內(nèi)的幾個基因是開花調(diào)節(jié)劑。只有FA和CaAP2 / CaFFN被描述為開花抑制基因，F(xiàn)A基因?qū)﹂_花時間的影響較小。盡管CaFFN基因純合突變體的枝條和果實大小有一定程度的縮小和極端開花時間表型，但它仍然是遺傳改良的理想育種材料。突變的CaFFN可以顯著減少 FFN 的數(shù)量，這使其對雜交辣椒育種非常有用。在我們的辣椒育種實驗中，該基因用于選擇早熟辣椒品種。

原文鏈接：

https://academic.oup.com/hr/article/doi/10.1038/s41438-021-00643-7/6491123?searchresult=1

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