癌癥的發(fā)展與靶蛋白的天然無(wú)序區(qū)(Intrinsically disordered regions, IDRs)異常密切相關(guān)。在人類血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，核孔蛋白(NUP98或NUP214)的染色體易位會(huì)產(chǎn)生一種異常嵌合，這種嵌合總是在核孔蛋白的IDRs區(qū)保留苯丙氨酸和甘氨酸殘基的串聯(lián)分散重復(fù)。然而，沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的IDRs如何促進(jìn)腫瘤發(fā)生尚不清楚。2021年6月23日，Jeong Hyun Ahn 等在Nature上面發(fā)表了題為“Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development”的文章，發(fā)現(xiàn)NUP98-HOXA9蛋白（一種經(jīng)常在白血病中檢測(cè)到的含有同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子嵌合體，）的IDRs嵌合可以產(chǎn)生液-液相分離(LLPS)并誘導(dǎo)白血病轉(zhuǎn)化。

——生物學(xué)背景——

轉(zhuǎn)錄因子，染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白和RNA結(jié)合蛋白中的IDRs通過(guò)相分離形成液滴，進(jìn)而影響生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞器的形成和基因轉(zhuǎn)錄的脅迫耐受。此外，許多癌癥蛋白也會(huì)反復(fù)融合編碼含IDRs和染色質(zhì)結(jié)合蛋白的基因。例如，顯示預(yù)后不良的白血病亞型患者攜帶包含核孔蛋白IDR和染色質(zhì)DNA結(jié)合因子的基因融合。同樣，尤因氏肉瘤中也存在轉(zhuǎn)錄因子與RNA結(jié)合蛋白IDR的異常融合。IDR結(jié)構(gòu)域?qū)χ铝鲂灾陵P(guān)重要，然而，目前尚不清楚IDRs如何調(diào)控基因異常和腫瘤發(fā)生。

——結(jié)果——

IDRs 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子相分離和腫瘤發(fā)生

為了研究IDRs和潛在的相分離在腫瘤發(fā)生中的作用，作者選用了具有致瘤性的NUP98–HOXA9 融合蛋白，它和來(lái)自各種白血病亞型的轉(zhuǎn)錄因子嵌合體有相似之處。NUP98-HOXA9包含兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，分散的苯丙氨酸和甘氨酸重復(fù)序列（FG）和GLE2-結(jié)合序列(GLEBS)。GLEBS的缺失不影響NUP98-HOXA9介導(dǎo)的相分離和初級(jí)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞分化(HSPCs)。為了更方便的研究NUP98 IDR在白血病發(fā)生中的作用，作者使用了GLEBS刪除的NUP98-HOXA9(以下簡(jiǎn)稱N-IDR_WT/A9)。

首先為了確定N-IDR_WT/A9puncta是否為相分離，作者使用1，6-己二醇處理細(xì)胞內(nèi)的N-IDR_WT/A9puncta，發(fā)現(xiàn)1，6-己二醇破壞N-IDR_WT/A9puncta形成，同時(shí)純化的NUP98 IDR (N-IDR)蛋白在體外形成了相分離，表明N-IDR_WT/A9通過(guò)相分離形成puncta。另外含有38×或36× FG重復(fù)序列的N-IDR產(chǎn)生相分離，但27×和11× FG重復(fù)序列在相同條件下無(wú)法相分離，只有在更高蛋白濃度或者crowding分子存在時(shí)才能發(fā)生相分離，說(shuō)明NUP98- HOXA9中的IDRs以依賴多價(jià)價(jià)數(shù)和濃度的方式產(chǎn)生相分離。此外，DNA結(jié)合區(qū)對(duì)NUP98- HOXA9的相分離并不是必需的。相對(duì)于N-IDR_WT，DNA結(jié)合缺陷型(攜帶一個(gè)N51S同源結(jié)構(gòu)域突變)形成了相當(dāng)少但更大的斑點(diǎn)。（見(jiàn)圖1）。

為了進(jìn)一步研究IDRs介導(dǎo)的LLPS與白血病發(fā)生之間的關(guān)系，我們用小鼠熱休克蛋白進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的致癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與N-IDR_WT/A9不同，N-IDR_WT/A9能有效形成相分離凝聚物，并具有強(qiáng)大的熱休克蛋白轉(zhuǎn)化能力。當(dāng)將FG重復(fù)序列中的苯丙氨酸突變成了絲氨酸破壞相分離形成時(shí)，Phe-Ser突變體不能在HSPCs細(xì)胞中產(chǎn)生相分離液滴，不能在體外轉(zhuǎn)化HSPCs，也不能在體內(nèi)誘導(dǎo)白血?。▓D1i–k）。

圖1. 嵌合轉(zhuǎn)錄因子癌蛋白中的IDRs形成相分離并誘導(dǎo)白血病發(fā)生。

IDRs增強(qiáng)嵌合體的染色質(zhì)結(jié)合

NUP98-HOXA9通過(guò)同源結(jié)構(gòu)域DNA結(jié)合，在白血病形成過(guò)程中導(dǎo)致基因失調(diào)。接下來(lái)，作者評(píng)估了IDRs介導(dǎo)的相分離對(duì)染色質(zhì)靶向性的影響。作者通過(guò)NUP98-HOXA9染色質(zhì)免疫共沉淀高通量測(cè)序(ChIP-seq)繪制具有相分離能力的N-IDR_WT/A9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和不具有相分離能力的N-IDRFS/A9穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系全基因組結(jié)合圖譜。N-IDR_WT/A9和N-IDRFS/A9均優(yōu)先與增強(qiáng)子結(jié)合，并最大富集hox相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。盡管N-IDR_WT/A9和N-IDRFS/A9有共同的靶向特征，但與無(wú)監(jiān)督聚類定義的峰亞類相比， N-IDR_WT/A9的基因組占用率顯著增強(qiáng)。此外，寬而密集的超級(jí)增強(qiáng)子峰是N-IDR_WT/A9所特有的，同時(shí)N-IDR_WT/A9富集與發(fā)育和白血病形成相關(guān)的基因，包括HOX、PBX3和MEIS1。另外，用1，6-己二醇處理破壞相分離顯著降低了N-IDR_WT/A9的染色質(zhì)結(jié)合，而對(duì)N-IDRFS/A9的整體結(jié)合影響很小。(圖2)

圖2. 相分離顯著增強(qiáng)NUP98-HOXA9的染色質(zhì)結(jié)合并結(jié)合具有超級(jí)增強(qiáng)子樣的基因組物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

IDRs增強(qiáng)靶基因激活

為了評(píng)估NUP9- HOXA9基因組結(jié)合和基因激活之間的關(guān)系，作者進(jìn)行了histone 3 Lys27 乙?；?H3K27ac) ChIP seq。RNA測(cè)序(RNA-seq)分析發(fā)現(xiàn)，與N-IDRFS/A9突變圖相比，N-IDR_WT/A9顯著上調(diào)了303個(gè)差異表達(dá)基因。在表達(dá)N-IDRFS/A9和N-IDR_WT/A9的293FT細(xì)胞中也觀察到IDRs依賴的基因激活。N-IDR_WT/A9維持致癌基因及與白血病相關(guān)基因的表達(dá)，但是N-IDRFS/A9突變體不能維持這些基因表達(dá)。此外，F(xiàn)G-repeat數(shù)量的減少，降低了NUP9- HOXA9蛋白相分離能力，也顯著減少了嵌合體致癌基因轉(zhuǎn)錄。因此，獨(dú)立模型的基因組圖譜強(qiáng)烈支持IDRs在激活原癌基因中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中包含由嵌合轉(zhuǎn)錄因子和H3K27ac結(jié)合的超級(jí)增強(qiáng)子樣元件。（圖3）

圖3. NUP98-HOXA9的IDR和相分離促進(jìn)靶癌基因激活和癌變。

IDRs和LLPS誘導(dǎo)染色質(zhì)環(huán)化

越來(lái)越多的證據(jù)表明染色質(zhì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相分離通過(guò)改變?nèi)S染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。然而，到目前為止，還沒(méi)有直接證據(jù)表明相分離可以形成DNA環(huán)，也沒(méi)有明確相分離驅(qū)動(dòng)的DNA環(huán)在人類疾病中的作用。為了檢測(cè)NUP98- HOXA9通過(guò)LLPS形成染色質(zhì)環(huán)的能力，作者對(duì)表達(dá)N-IDR_WT/A9和N-IDRFS/A9的293FT細(xì)胞進(jìn)行了Hi-C譜分析，結(jié)果顯示有6615個(gè)DNA環(huán), 并在復(fù)制間具有高度相關(guān)性。為了確定N-IDR_WT/A9對(duì)Hi-C接觸頻率的影響，作者對(duì)N-IDR_WT/A9表達(dá)細(xì)胞和N-IDRFS/A9表達(dá)細(xì)胞中500個(gè)最強(qiáng)烈的接觸位點(diǎn)之間的相互作用進(jìn)行了聚類。N-IDR_WT/A9占據(jù)率高的區(qū)域表現(xiàn)出更高的相互作用頻率，甚至存在于距離很遠(yuǎn)的結(jié)合位點(diǎn)之間(大于2Mb)或完全在不同的染色體上。在表達(dá)N-IDRFS/A9的細(xì)胞中，相同基因座之間的相互作用頻率沒(méi)有增加(圖4b)。差異分析顯示有232個(gè)特異性N-IDR_WT/A9和52個(gè)特異性N-IDRFS/A9(DESeq2, P<0.01)。與N-IDRFS/A9細(xì)胞相比，與啟動(dòng)子相關(guān)的特異性loop anchors在N-IDR_WT/A9細(xì)胞中表達(dá)增加，表明了這些DNA環(huán)的調(diào)節(jié)作用。調(diào)節(jié)基因在N-IDR_WT/A9中的特異性loop anchors包括原癌基因,如HOX和PBX3。嵌合轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)相分離誘導(dǎo)超級(jí)增強(qiáng)子靶位點(diǎn)和致癌基因之間相互作用形成DNA環(huán)。

圖4. NUP98-HOXA9中具有相分離能力的IDRs誘導(dǎo)癌基因形成DNA環(huán)。

——小結(jié)——

總的來(lái)說(shuō)，本文作者發(fā)現(xiàn)NUP98-HOXA9嵌合蛋白中具有液液相分離活性的IDRs對(duì)白血病發(fā)生和致癌基因表達(dá)程序的激活至關(guān)重要。這些作用是通過(guò)IDRs增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子與基因組靶蛋白之間的結(jié)合能力，和促進(jìn)增強(qiáng)子和致癌基因啟動(dòng)子之間的長(zhǎng)距離DNA環(huán)形成所介導(dǎo)的。該研究為腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中相分離驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和3D染色質(zhì)重組的致癌突變提供了一個(gè)原理例證。

參考文獻(xiàn)：

Ahn, J. H. et al. Phase separation drives aberrant chromatin looping and cancer development. Nature, doi:10.1038/s41586-021-03662-5(2021).