摘要：
修飾性肽配體是在抗原表位的基礎(chǔ)上對表位進(jìn)行氨基酸改造形成的具有免疫調(diào)節(jié)活性的短肽，已經(jīng)在治 療自身免疫疾病、惡性腫瘤和病毒感染等疾病方面顯示出良好的應(yīng)用前景。一方面，修飾性肽配體可通過影響天然 抗原表位、主要組織相容性復(fù)合體和T細(xì)胞受體形成的三分子結(jié)構(gòu)發(fā)揮特異性免疫調(diào)節(jié)作用；另一方面，修飾性肽 配體還可通過改變抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)信號、旁路抑制和激發(fā)異源性免疫反應(yīng)等機制發(fā)揮治療作用。結(jié)合使用噬菌體 展示技術(shù)對肽庫進(jìn)行篩選，可獲得大量高特異性和高親和力修飾性肽配體。修飾性肽配體作為潛在抗原特異性藥 物的重要來源正在受到廣泛關(guān)注。
特異性抑制針對自身抗原和變應(yīng)原的反應(yīng)性淋 巴細(xì)胞功能是防治自身免疫病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的 理想方法和最終解決途徑，其中治療性肽疫苗最具 發(fā)展前景。治療性肽疫苗可通過自身抗原T輔助 細(xì)胞(T helper Cell,Th)表位代替完整抗原誘導(dǎo)免疫 耐受。在自身抗原表位的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對表位進(jìn)行氨基酸改造則形成修飾性肽配體(altered peptide ligand,APL)。APL通過與自身抗原天然表位競爭 性結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell,APC) 上的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)或T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR),發(fā)揮特異性免疫調(diào)節(jié)作用。這種肽疫苗本 身不具有免疫原性，因此與直接應(yīng)用表位肽誘導(dǎo)耐 受相比更為安全。
APL還可針對腫瘤或病毒免疫顯性表位進(jìn)行修 飾，增加免疫原性，以用于腫瘤和病毒感染性疾病的免疫預(yù)防和治療。本文綜述了APL的作用機制、治 療學(xué)應(yīng)用以及結(jié)合噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行APL篩選 相關(guān)進(jìn)展。
1 APL 的概念
從廣義上講，APL是指任何受體配基發(fā)生一個 或多個氨基酸修飾并導(dǎo)致受體信號功能性改變的肽 段。即使只有一個氨基酸發(fā)生變化，也會引起給定 肽段所誘導(dǎo)受體信號和細(xì)胞功能發(fā)生明顯改變，這 種現(xiàn)象為使用APL特異性調(diào)節(jié)受體功能開啟了大 門[1]。
2 APL的作用和機制
2.1 APL對TCR信號的影響
T淋巴細(xì)胞能選擇性針對病原體產(chǎn)生反應(yīng)和免 疫記憶，此選擇性是基于MHC分子、抗原肽表位 和TCR的特異性結(jié)合。如果把MHC和TCR與肽 的相互作用表面看作具有不同大小和電荷的口袋， 那么肽的氨基酸側(cè)鏈就是填充口袋的最佳配體。通 過內(nèi)氨酸替代、定向誘變以及肽庫技術(shù)研究給定肽 段個體氨基酸的功能，表明并非所有氨基酸對受體 功能都具有相同的重要性。采用丙氨酸替代和組合 肽庫預(yù)測TCR結(jié)合顯示單一TCR能夠識別成干個 不同肽段。假定每一對MHC-TCR組合有一個最佳 配體，那么其他肽段對MHC和TCR的親和力則較 低。根據(jù)激活或抑制T細(xì)胞反應(yīng)的不同參數(shù)，TCR 配體可以被分為激動劑、超激動劑、部分激動劑和 拮抗劑。激動劑包括完全激動劑和弱激動劑。完全 激動劑具有高度免疫原性，可誘導(dǎo)給定T細(xì)胞所有 功能(包括細(xì)胞增生、細(xì)胞溶解、細(xì)胞因子和趨化 因子釋放、表面受體表達(dá)上調(diào));弱激動劑也能誘 導(dǎo)完全T細(xì)胞活化但反應(yīng)幅度較弱，且只有在較高 濃度時，才顯示出明顯作用。超激動劑能夠誘導(dǎo)比 最初免疫原性表位更高幅度的T細(xì)胞反應(yīng)[2]。部 分激動劑選擇性誘導(dǎo)某些T細(xì)胞功能，但不能誘導(dǎo) 細(xì)胞增牛。拮抗劑通常不誘導(dǎo)任何特異性功能，但 在與激動劑同時存在時，拮抗劑能與TCR結(jié)合，抑 制激動劑的正常刺激功能。
因為大多數(shù)TCR屬于退化的配基識別，可以和 成千的不同肽段結(jié)合，所以針對TCR的APL設(shè)計非 常復(fù)雜。TCR信號的有效活化不僅與識別的肽段 有關(guān)，而目與T細(xì)胞相互作用的大量輔助因子有 關(guān)。因此TCR對不同肽段的識別以及對T細(xì)胞功 能的調(diào)節(jié)，還有賴于T細(xì)胞的活化和分化狀態(tài)。另 外，T細(xì)胞的終末分化情況由未活化T細(xì)胞與特殊 抗原第一次相遇和隨后的再刺激決定；T細(xì)胞的等級性活化由最初條件決定。這些最初條件包括抗原 類型、抗原劑量、免疫途徑和頻率、佐劑類型、固有免 疫激活程度、宿主的遺傳、營養(yǎng)和生理條件等。多種 最初條件之間可發(fā)生相互作用，決定已接觸抗原T 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，調(diào)節(jié)不同表面粘附分子 或趨化因子受體表達(dá)，因此，最初條件通常促進(jìn)T 細(xì)胞表型移動，而APL卻誘導(dǎo)與天然表位肽完全相 反的T細(xì)胞表型1。
2.1.1 CD4+T細(xì)胞
CD4*T細(xì)胞通常用來識別 非自身肽，而改變TCR配體可以改變T細(xì)胞反應(yīng)。T細(xì)胞的識別和反應(yīng)曾經(jīng)被認(rèn)為是有或無的反應(yīng)，但最新研究表明由同一MHCⅡI分子呈遞的單一氨 基酸殘基發(fā)生替換的類似抗原肽或由不同MHCII 分子呈遞的同一個特異性抗原肽可表現(xiàn)出有限的多 形性。
重要氨基酸替代可導(dǎo)致T細(xì)胞效應(yīng)的部分或 完全拮抗，因此APL還會影響Th分化方向的改變。根據(jù)效應(yīng)Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子類型的不同，可將其分為Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)和Th17等4種細(xì)胞亞型。TCR或肽段發(fā)生單 一氨基酸變化可改變Th分化方向。例如，TCRα鏈 互補決定區(qū)2中一個氨基酸殘基變化導(dǎo)致幼稚CD4 T細(xì)胞分化方向從Th1向Th2方向漂移；髓鞘堿性 蛋白(myelin basic protein,MBP)與髓鞘少突膠質(zhì)細(xì) 胞糖蛋白和蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(proteolipid protein, PLP)被認(rèn)為是多發(fā)性硬化的中樞性自身抗原，也可 通過調(diào)節(jié)CD4 T細(xì)胞極化方向誘導(dǎo)實驗性自身免 疫性腦炎(experimental autoimmune encephalomye- litis,EAE);人MBP83-9(ENPVVHFFKNIVTPR-TP) 用丙氨酸替代86位纈氨酸(86A)可產(chǎn)生Th1免疫 傾向；而用丙氨酸替代88位組氨酸(88A)可產(chǎn)生 Th2免疫傾向[3]。
另外，APL還可調(diào)節(jié)趨化因子和趨化因子受體 表達(dá)。接觸PLPso-1si的SJL小鼠高表達(dá)趨化因子，如巨噬細(xì)胞趨化蛋白- 1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白 (macrophage-inflammatory protein,MIP)- 1α、MIP- 1B、 MIP-2 、fractalkine 以及干擾素誘導(dǎo)蛋白10等，和 Th1相關(guān)趨化因子受體，如CCR5和CXCR3;接受 APL動物CCR5和CXCR3表達(dá)水平明顯降低， Th2 相關(guān)趨化因子受體CCR3和CCR4表達(dá)增加。以上結(jié)果支持APL下調(diào)Th1的假設(shè)4。
2.1.2 CD4+ CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞
Treg細(xì)胞可抑制Th1和Th2介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)并在保持外周 耐受中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞可分為自然發(fā)生型(CD4*CD25+Treg) 、適應(yīng)型、CD4*CD45 Rb{"和 CD4*LAP+Treg等細(xì)胞類型。自身免疫性重癥肌無 力相關(guān)研究表明，具有兩個氨基酸改變的雙重APL (Lys-262-Ala-207)顯著上調(diào)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen, CTLA)4 、CD45 Rb1~ 、叉狀頭螺旋轉(zhuǎn)錄因子( forkhead helix transcription factor,Foxp3) 、細(xì)胞內(nèi)腫瘤生長因 子(tumor growth factor,TGF)- β和neuropilin等表達(dá) 水平，誘導(dǎo)CD4 · CD25 · Treg產(chǎn)生[5 。CD45Rb1~ 通過白細(xì)胞介素(interleukin,IL)- 10和TGF-B介導(dǎo) 特異性免疫調(diào)節(jié)作用，可上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CTLA-4表達(dá)， 是潛在的免疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)；CTLA-4作為負(fù)性共刺激因 子，在外周耐受方面發(fā)揮重要作用；Neuropilin,一種 軸突導(dǎo)向受體蛋白，與Foxp3共表達(dá)，被認(rèn)為是CD4*CD25*Treg的重要標(biāo)志之一，并參與下調(diào)自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性。另外，雙重APL還可通過促進(jìn) Fas-FasL介導(dǎo)的凋亡下調(diào)自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性， 逆轉(zhuǎn)實驗性自身免疫性重癥肌尤力
2.1.3 CD8*CTL
由于具有調(diào)節(jié)人類免疫缺陷 病毒和黑色素瘤特異性CTL反應(yīng)功能，APL已應(yīng)用 于多種自身免疫性疾病的治療和研究。肽段 SIINFEKL可導(dǎo)致肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞缺失，使體內(nèi) CTL功能受損[8]。相反，低親和力肽段G4不會導(dǎo) 致肝內(nèi)CD8+T細(xì)胞缺失，高濃度G4甚至還能阻斷 肽段SIINFEKL所致活化CD8+T細(xì)胞丟失。
APL還可直接調(diào)節(jié)細(xì)胞毒作用。在沒有外界幫 助的情況下，部分激動劑肽段轉(zhuǎn)變?yōu)橐种菩噪亩?，?nbsp; 去刺激特異性CTL增生作用，抑制它們對重復(fù)刺激 的反應(yīng)，誘導(dǎo)非依賴死亡受體凋亡。CTL對病毒或 腫瘤的反應(yīng)以CTL表位經(jīng)常突變和功能異常CD4 特異性T細(xì)胞反應(yīng)為特征，部分激動劑的這種生物 學(xué)活性改變可能參與CTL對病毒或腫瘤的作用[21。通過改善APL與MHC分子或TCR的親和力則可誘 導(dǎo)CTL產(chǎn)生9],發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此通過對以 上效應(yīng)的分析提示，APL可在改善針對自身免疫性 疾病、病毒、腫瘤的免疫控制以及異種移植排斥方 面[10]提供新的策略。
2.2 APL對APC 的影響
某些APL可以誘導(dǎo)APC細(xì)胞內(nèi)信號改變，導(dǎo)致 隨后的T細(xì)胞反應(yīng)也隨之發(fā)生改變。如TCR-MHC- 肽復(fù)合物可通過控制APC產(chǎn)生Ⅱ-12水平?jīng)Q定Th1 分化方向，為Th2相關(guān)疾病如過敏性疾病提供治療 途徑。醋酸格拉替雷(glatiramer acetate)激活樹突 狀細(xì)胞(dendritic cell,DC),通過上調(diào)人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)-DR和CD86表達(dá) 促進(jìn)Th2型免疫反應(yīng)，抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，減少 IL- 12產(chǎn)生，與干擾素(interferon,IFN)- β協(xié)同抑制 多發(fā)性硬化患者DC上CD1a表達(dá)而增加CD86表達(dá)
2.3 APL的旁路抑制
MHC多樣性、動物間免疫遺傳差異以及感應(yīng)T 細(xì)胞群TCR的廣泛多樣性是在TCR特異性方式下 使用APL的障礙。然而，動物實驗表明APL的效應(yīng)機制不僅限于對三分子復(fù)合物的調(diào)節(jié)。在復(fù)發(fā)-弛 張性EAE為特征的SJL小鼠模型中，每一次疾病加 劇過程都伴隨主要T細(xì)胞反應(yīng)從一種表型轉(zhuǎn)移為 另一種致腦炎表型轉(zhuǎn)移現(xiàn)象(表位擴展),人體也可 能存在這種機制?；赑LP139-1s1的APL可以預(yù)防 免疫顯性致腦炎原PLP139-151以及隨后表位擴展為 PLPrg-101的反應(yīng)，其至可以預(yù)防鼠MBP誘導(dǎo)的疾 病。這是因為它能夠有效激活A(yù)PL特異性的免疫 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，促進(jìn)這種免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移到炎 癥部位，通過與組織損傷過程中釋放的天然抗原交 叉作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，如I4、IL-10、IL-13和 TGF- β等[21。釋放的這些炎癥因子隨后通過抗原 非特異性方式下調(diào)正在進(jìn)行的免疫過程，這種調(diào)節(jié) 機制被稱為旁路抑制。
2.4 APL異源性激發(fā)特異性免疫反應(yīng)
APL可誘導(dǎo)異常免疫反應(yīng)。APL免疫小鼠后， 在體外用天然非最佳配體擴增APL特異性T細(xì)胞， 導(dǎo)致可識別APL的高功能性、高親和力T細(xì)胞擴 增。這種現(xiàn)象是由于單一肽免疫誘導(dǎo)不均一和多克 隆T細(xì)胞反應(yīng)；反應(yīng)細(xì)胞的選擇性不是隨機的，只 有預(yù)設(shè)敏感性閾值的T細(xì)胞能夠有效地從T細(xì)胞 池里面擴增出來。調(diào)節(jié)免疫肽的劑量可以擴增完全 不同的T細(xì)胞池：從胸腺負(fù)性選擇中逃脫進(jìn)入外周 的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，其TCR與自身抗原的親和力 通常較低，它們只被很高濃度的APL或天然配體激 活和擴增；而能夠識別隱藏表位具有高度親和力的 T細(xì)胞群進(jìn)入外周被APL激活，可導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，識別天然抗原，使自身免疫過程永存。增加APL 免疫原性及其與天然肽之間的交叉反應(yīng)或其異源性 激發(fā)特異免疫反應(yīng)功能在疫苗設(shè)計中具有重要意 義[13]。
3 APL的治療學(xué)應(yīng)用
APL能有效治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA) 、1型糖尿病、重癥肌無力、 EAE等多 種自身免疫病，然而動物模型與相應(yīng)的人類疾病存在某些差異[1]。首先，致病自身抗原不同。動物模 型中自身抗原是已知的，可誘導(dǎo)疾病發(fā)生。不同致 病自身抗原在不同動物品系具有不同致病潛力。例 如，對于以復(fù)發(fā)-弛張性EAE為特征的SJL小鼠， PLP39- 1s1是顯性致腦炎因子， PLP178- 191和MBP84- 10 是低致腦炎因子；對于PL/JxSJL/JHI小鼠， MBP87-99 是致腦炎因子。然而，對于特定人類自身免疫病患 者而言，研究者還無法確定哪一個候選自身抗原具 有致病性，并有可能出現(xiàn)表位擴展。其次，自體反應(yīng) T細(xì)胞功能狀態(tài)不同。動物自身免疫病是通過主動 免疫或被動導(dǎo)入自體反應(yīng)T細(xì)胞形成的。自體反 應(yīng)T細(xì)胞在有限數(shù)量活化后處于未成熟或早期效 應(yīng)狀態(tài)。但是，在人類自身免疫病診斷或治療選擇 的時候，其自體反應(yīng)T細(xì)胞可能已經(jīng)經(jīng)歷了多次活 化循環(huán)，有的甚全已經(jīng)形成終末分化效應(yīng)細(xì)胞或記 憶細(xì)胞。再者，免疫遺傳背景存在多樣性。自身免 疫病動物模型是在特定的品系上建立的，不同品系 MHCII表型不同對疾病的易感性也不同，如小鼠 MHCⅡI編碼區(qū)域主要是IA和IE兩個等位基因；而 人類可表達(dá)8個以上MHCⅡI等位基因。另外，APL 的安全性是必須考慮的問題。APL的保護性效應(yīng)即 使在很好的確認(rèn)系統(tǒng)下也僅僅是66%;APL單獨免 疫動物時，1%的動物會形成EAE,提示APL治療本 身存在一些比較低的誘導(dǎo)疾病的危險。
近來，APL在治療變態(tài)反應(yīng)性疾病[41、人類 RA、銀屑病、1型糖尿病和多發(fā)性硬化等方面取得 了良好的進(jìn)展。例如，含有TCR接觸殘基的多個 氨基酸替代的膠原Ⅱ( collagen Ⅱ,CⅡI)263-22衍生肽 段，可劑量依賴性抑制天然抗原CII263-27誘導(dǎo)的T 細(xì)胞活化，同時抑制Thl細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞表面 標(biāo)志分子表達(dá)[15]。角質(zhì)素17修飾肽119R和355L 可抑制銀屑病患者T細(xì)胞增殖，降低IFN-y和IL-2 水平，增加I4、IL-10、TGF- β水平，增強Th2型 免疫反應(yīng)，抑制角質(zhì)化細(xì)胞增生[16]。胰島素B鏈 氨基酸9-23肽段是1型糖尿病患者IFN- γ產(chǎn)生的 Thl淋巴細(xì)胞識別表位，對其進(jìn)行修飾得到的NBI- 6024具有免疫調(diào)節(jié)作用，可顯著增加I-5分泌。I 期臨床實驗結(jié)果也支持其保護性Th2調(diào)節(jié)作用。目 前已進(jìn)入Ⅱ期臨床研究[17]。
最近有報道表明流感病毒凝血素(influenza virus haemagglutinin,HA)衍生肽段可以抑制RA患 者HLA-DR4/1特異性肽段所致T細(xì)胞活化[]。修 飾性HA3o8-317肽段與細(xì)胞表面HLA-DR4/1結(jié)合的 能力比CII263-22高，可阻斷HLA-DR4/1與其他抗原肽結(jié)合從而取消HAao8-317或CI263-22所致T細(xì)胞增 生和CD25表達(dá)，提示APL具有潛在的RA治療作 用 。
4 噬菌體展示技術(shù)在APL篩選中的作用
大多數(shù)生物藥物通過作用于蛋白靶點、改變蛋 白和細(xì)胞行為發(fā)揮作用。通過噬菌體展示技術(shù)發(fā)現(xiàn) 的、與蛋白靶點具有高親和力和特異性結(jié)合的肽，具 有制造費用較低、活性較高(15～60倍)、知識產(chǎn)權(quán) 壁壘較少、穩(wěn)定性較高、與免疫系統(tǒng)發(fā)生不相關(guān)相互 作用的機會較少、器官和腫瘤穿透性較好等優(yōu)點，甚 至可以和抗體相媲美,成為生物制藥中一種可靠替代品。
噬菌體肽庫包含1×101°個由10～50個氨基酸 組成的肽段(遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過組合的小分子庫),而且含有 組合的殘基(即在可變的殘基上增加結(jié)構(gòu)),能夠快 速提供結(jié)合于靶蛋白不同部位的成百結(jié)合物。目前 大多數(shù)治療肽都是激動劑，但是在腫瘤和炎癥治療 中，能阻斷參與疾病進(jìn)程活化受體的阻斷劑引起人 們的重視。通過噬菌體展示既可以得到作用增強的 肽，如可在體內(nèi)產(chǎn)生長期細(xì)胞毒作用的CTL表位 肽[1],也可通過控制肽和靶點相互作用的長度和內(nèi) 容得到阻斷蛋白之間相互作用的肽[20]。
另外，TCR是獲得性免疫系統(tǒng)中除抗體外僅有 的抗原識別分子。高親和力TCR具有特異性高、副 作用較小等特點，可成為新的治療靶點，天然親和力 較低是其主要缺點。通過噬菌體展示技術(shù)可以使 TCR的親和力提高白萬倍。例如，通過噬菌體展示 技術(shù)可獲得與細(xì)胞表面的肽-MHC復(fù)合物高特異性 和敏感性結(jié)合的TCR[21]。此外，Dunn等[2]還得到 了親和性增加、沒有明顯交叉作用的人類TCRCDR2 殘基。
5 結(jié)語
APL能特異性地針對自身抗原和變應(yīng)原表位進(jìn) 行修飾，代替完整抗原實現(xiàn)免疫耐受；可針對腫瘤或 病毒免疫顯性表位進(jìn)行修飾，增加其免疫原性，作為 腫瘤或感染的多肽疫苗；還可通過阻斷參與疾病 (如腫瘤和炎癥等)進(jìn)程的活化受體，產(chǎn)牛與封閉 肽[23]相似的治療作用。盡管APL的作用機制需進(jìn) 一步研究，但由于其抗原特異性治療的特點，APL仍 然得到了臨床醫(yī)生和科學(xué)家的廣泛關(guān)注。而且，隨 著噬菌體展示技術(shù)在肽藥物篩選中的應(yīng)用，APL有 望成為新一代藥物的重要來源。APL相關(guān)作用機制 研究也有利于研究者對疾病發(fā)展和機制的深入認(rèn)識 及克服疾病治療過程中遇到的困難。
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