神經(jīng)退行性疾病是影響全球數(shù)百萬人的高度致殘且最終致命的疾病，主要包括肌萎縮側索硬化癥 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、帕金森病 (Parkinson's disease, PD)、阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 和亨廷頓病 (Huntington's disease, HD)。在神經(jīng)退行性疾病中，特定的神經(jīng)元亞群，例如多巴胺能和膽堿能神經(jīng)元或運動神經(jīng)元會逐漸退化，導致特定模式的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。傳統(tǒng)藥物治療用于延緩疾病進展，不能使功能修復或組織再生[1]。
神經(jīng)干細胞 (Neural stem cells, NSCs) 在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性、衰老、疾病和再生方面具有重要作用。基于體內移植的 NSCs 具有自我更新、增殖、多向分化、低免疫原性和遷移的特點，NSCs 移植的成為了極具前景的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病療法，為腦損傷修復以及神經(jīng)性疾病的治療帶來了希望。
關于神經(jīng)干細胞及其分化
神經(jīng)干細胞 (NSCs) 被喻為中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的 “種子” 細胞，不同神經(jīng)細胞系的產(chǎn)生起源于成體神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞命運的調控更是一個精細的過程，依賴于從表觀遺傳延伸到翻譯水平的復雜調控網(wǎng)絡，且涉及細胞外基質成分[2]。
成體 NSCs 可以自我更新或響應特定刺激分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞或少突膠質細胞 (圖 1)，不同譜系的神經(jīng)細胞功能各異。
圖 1. NSCs 分化途徑以及譜系特異性標志[3]
神經(jīng)元 (Neurons) 是神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能的基本單位，通過軸突和樹突傳遞信號。典型的神經(jīng)元由樹突、細胞體、軸突 (包括軸突丘) 和突觸前末端組成。神經(jīng)元自身不能再生。移植外源性 NSCs 或動員內源性 NSCs，使其分化為神經(jīng)元，重建損傷的神經(jīng)回路，是一種被廣泛探索的治療神經(jīng)退行性疾病的方法。
星形膠質細胞 (Astrocytes) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中最豐富的細胞類型，它們與神經(jīng)元、少突膠質細胞和內皮細胞交流，并在結構上支持它們生長，整合為三聯(lián)突觸和神經(jīng)血管單位，履行其功能。除了參與細胞通訊外，星形膠質細胞還能通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，如膠質細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)，以及降低神經(jīng)元的興奮中毒，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
少突膠質細胞 (Oligodendrocytes, OLGs) 是有髓鞘的膠質細胞，對神經(jīng)元電絕緣、促進跳躍信號傳導非常重要。少突膠質細胞還通過髓磷脂膜為神經(jīng)元軸突提供代謝和營養(yǎng)支持，包括乳酸、丙酮酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 等神經(jīng)營養(yǎng)因子。
神經(jīng)干細胞，該如何培養(yǎng)？
可以通過三種不同的方法獲得 NSCs (圖 2)：(1) 從原發(fā)性 CNS 組織直接提取，包括腦和脊髓組織；(2) 分化多能干細胞，例如胚胎干細胞和誘導性多能干細胞；(3) 轉分化體細胞，如皮膚成纖維細胞和血細胞。從上述來源產(chǎn)生的 NSCs 可以通過基因改造，進一步永生化[1]。圖 2. NSCs 的來源[1]
如何有效地將 NSCs 誘導成特定的細胞類型? 神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子參與了 NSCs 增殖和分化的內源性調控，已被證明能誘導 NSCs 分化。目前已經(jīng)開發(fā)了不同的 NSCs 分化方案。大多數(shù)都是基于含有生長因子的培養(yǎng)基，NSCs 在其中粘附和增殖。這些生長因子包括成纖維細胞生長因子 (FGF) 和/或表皮生長因子 (EGF)、神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 和膠質源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF) 等。
如在下文中，作者團隊發(fā)表了一種快速、高效的分化方法，通過使用含有必要生長因子的選擇性培養(yǎng)基從骨髓來源的細胞中生成小鼠 OLGs。通過該方案，可以在 7-8 周內獲得成熟的 OLGs (與以前的工作相比，獲得 OLGs 的時間更短)。
作者團隊的方法主要包括三個步驟: 骨髓來源的 NSCs 生成、NSCs-OPCs 分化和 OLGs 成熟[4]。
骨髓來源的 NSCs 生成：收集骨髓組織切小塊，消化，將細胞懸浮在無血清 DMEM/F12 中，添加 2% B27 補充劑， 20 ng/mL EGF 和 10 ng/mL bFGF ，同時添加 100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素。隨后將細胞懸浮在 NSC-PM (神經(jīng)干細胞增殖培養(yǎng)基)中，并包裹于含聚 D-賴氨酸和層粘連蛋白的 24 孔板。10-14 天后，形成類似神經(jīng)球的細胞團簇。
骨髓來源的 NSCs-OPCs 的分化和增殖：形成的神經(jīng)球被消化到單細胞中，在 NSC-PM 中培養(yǎng)。每個孔中的神經(jīng)球被消化成單細胞，在特定的 NSCs 分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
星形膠質細胞分化時，DMEM 中添加 1% N2、2 mM GlutaMax-I 和 1% FBS。OLGs 分化培養(yǎng)基添加 2% B27、2 mM GlutaMax-I 和 20 ng/mL T3 的 neuro 培養(yǎng)基。2 周后，分化培養(yǎng)基中的 NSCs 形態(tài)發(fā)生變化，并且能檢測到神經(jīng)元、星形膠質細胞和 OLGs 的標記物。
OLGs 成熟：在 OLGs 成熟過程中，用 DPBS 緩沖液洗去生長因子 (PDGF-AA 和 bFGF)，加入新鮮 EOLG-DM (早期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 誘導 OLGs 分化，然后將在EOLG-DM 培養(yǎng)基中生長 4 天的 OPCs 轉移到 LOLG-DM (晚期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 中再生長 10 天，并通過添加 cAMP 加速 OLGs 分化的分支生長。
圖 3. 從小鼠自體骨髓來源的 NSCs 中生成少突細胞祖細胞 (OPCs) 和少突膠質細胞[4]
此外，越來越多的科研人員關注多種神經(jīng)營養(yǎng)因子/細胞因子聯(lián)合使用。Kyung-Chul Choi 教授團隊證明了生長因子的組合使用 (bFGF+IGF-I、bFGF+NGF、bFGF+BDNF、BDNF+IGF-I、bFGF+NGF) 對 NSCs 分化為神經(jīng)元的效果比單個生長因子 (bFGF、IGF-I、BDNF 和 NGF) 處理結果更顯著[5]。
NSCs 移植與阿爾茨海默癥治療
阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 是一種神經(jīng)退行性疾病，由皮質和皮質下區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少引起，其發(fā)展主要與淀粉樣蛋白 (Aβ) 蛋白的積累和 Tau 蛋白的過度纏結相關。AD 的主要癥狀包括記憶力減退和認知障礙，大部分患者為老年人。AD 不僅降低老年人的生活質量，也加劇老齡化相關的經(jīng)濟負擔，因此，AD 的治療是眾多研究者重點關注的課題。目前治療 AD 的常用藥物有多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏、他克林4 種乙酰膽堿酯酶抑制劑，以及 1 種 NMDA 受體拮抗劑美金剛。但藥物無法再生已損傷或丟失的神經(jīng)元，對于已有明顯癥狀患者治療效果并不明顯。NSCs 能夠自我更新并分化各種神經(jīng)細胞，NSCs 移植療法已顯示出治療 AD 的巨大潛力。移植后，NSCs 分化為神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質細胞并釋放營養(yǎng)因子，從而修復 AD 引起的認知障礙 (圖 4)。然而，盡管 NSCs 移植能再生神經(jīng)元，但對已產(chǎn)生的 Aβ 卻無法有效清除，這對移植后 NSCs 的存活也有不利的影響。對于 NSCs 的改造也是一個新興的研究課題。
圖 4. NSCs 移植途徑及認知障礙修復機制：觸發(fā)內源性突觸形成、內源性神經(jīng)形成影響行為表現(xiàn)、調節(jié) Aβ 聚集[6]
接下來小 M 來介紹一個在 APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠中移植 NSCs 治療 AD 的例子~ 蘇州納米所王強斌團隊開發(fā)了一種能夠穩(wěn)定和持續(xù)表達腦啡肽酶 (NEP) 的基因工程 NSCs。NSCs 經(jīng)改造后，在細胞膜上表達的 NEP 和釋放的胞外載體可持續(xù)降解 Aβ，提高 NSCs 和內源性神經(jīng)細胞的存活率。PPAR-siSOX9 納米制劑可通過協(xié)同調節(jié) Wnt/β-catenin 和 RA 信號通路來提高 NEP-NSC 的分化效率。研究者們將改造的 PPAR-siSOX9 納米制劑-NEP-NSCs 立體定向移植到 APPswe/PS1dE9 雙轉基因 AD 小鼠模型的海馬體中(海馬體是大腦中最容易受到 AD 病理學損傷形成的區(qū)域)。與對照組相比，經(jīng)過治療后的 AD 小鼠具有更高活力和更高密度的神經(jīng)元，并且具有更高的存活率。治療一個月后，大腦中的病理性 Aβ 聚集的斑塊面積和大小也顯著降低 (圖 5)。在 Morris 水迷宮實驗中證明，納米制劑-NEP-NSCs 治療小鼠更頻繁地穿過平臺并在目標象限中游泳的時間更長。這些結果表明，經(jīng)改造后的納米制劑-NEP-NSCs 在 AD 小鼠模型中能更有效地降解 Aβ 以及再生神經(jīng)元，逆轉了小鼠記憶與學習缺陷。
圖 5. NSCs 移植治療后 AD 小鼠大腦中 Aβ 定量檢測。G1：健康小鼠；G2：PBS 處理組；G3：NSC 治療組；G4：納米制劑-NSC 治療組；G5：NEP–NSC 治療組；G6：納米制劑-NEP-NSC 治療組[7]
除了阿爾茨海默癥，在其他疾病如帕金森病 (PD)、肌萎縮側索硬化癥 (ALS)、亨廷頓病 (HD)、中風、創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中，NSCs 移植也表現(xiàn)出巨大的潛力。表 1. 通過神經(jīng)干細胞移植治療神經(jīng)疾病動物模型 (部分參考) [1]
PMID (從上至下):
17038899, 27213850, 25022790, 18683244, 27562609, 25132189
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參考文獻
1. Yuewen Tang, L Cheng, et al. Current progress in the derivation and therapeutic application of neural stem cells. Cell Death Dis. 2017 Oct 12;8(10):e3108.
2. Yanjing Zhu, Ruiqi Huang, Liming Cheng, Rongrong Zhu, et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.Nat Commun. 2021 May 10;12(1):2614.
3. Roberta De Gioia, Stefania Corti, et al. Neural Stem Cell Transplantation for Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2020 Apr 28;21(9):3103.
4. Yuan Zhang, Xin-Yu Lu, Giacomo Casella, Jing Tian, Xing Li, et al. Generation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Bone Marrow Cells.Front Cell Neurosci. 2019 Jun 5;13:247.
5. Kyung-Chul Choi,Do-Sung Yoo, et al. Effect of Single Growth Factor and Growth Factor Combinations on Differentiation of Neural Stem Cells. J Korean Neurosurg Soc. 2008 Dec; 44(6): 375-381.
6. Hayashi Y, Tsai KJ, et al. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models. J Biomed Sci. 2020 Jan 27;27(1):29.
7. Huang D, Wang Q, et al. A Nanoformulation-Mediated Multifunctional Stem Cell Therapy with Improved Beta-Amyloid Clearance and Neural Regeneration for Alzheimer's Disease. Adv Mater. 2021 Apr;33(13):e2006357.
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