PCR引物設(shè)計(jì)｜第1期. 手把手教你學(xué)會(huì)用Pubmed進(jìn)行引物設(shè)計(jì)
今天給大家介紹一個(gè)適合科研小白的引物設(shè)計(jì)方法，我們以小鼠的p53基因?yàn)槔?/span>
1.基因序列檢索
打開(kāi)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站，選擇nucleotide，輸入我們要檢索的基因p53，在右邊的Top Organisms下邊選擇基因所屬的物種Mus musculus，進(jìn)入如下界面，第二個(gè)即為小鼠p53基因的mRNA序列。點(diǎn)擊第二個(gè)Mus musculus mRNA for p53. complete cds，進(jìn)入小鼠p53基因mRNA序列界面。該部分會(huì)介紹基因序列的相關(guān)信息，包括基因長(zhǎng)短，CDS區(qū)的范圍及基因序列等信息。點(diǎn)擊右側(cè)的Pick primers進(jìn)入引物設(shè)計(jì)界面。
2.引物設(shè)計(jì)
如果是qPCR引物設(shè)計(jì)，通常只需要將PCR product size大小設(shè)置為80-150, organism設(shè)置為小鼠（10090）即可，點(diǎn)擊左下角的Get Primers即進(jìn)入設(shè)計(jì)的引物信息界面。如果對(duì)所設(shè)計(jì)的引物位置有特殊要求，可以在下圖右上角的range里邊填入上游引物和下游引物的位置范圍即可。
如果所設(shè)計(jì)的引物需要跨越外顯子，可以在Exon
junction span選擇Primer must span an
exon-exon junction。
設(shè)置完以上參數(shù)后，點(diǎn)擊Get
primers即進(jìn)入到設(shè)計(jì)好的引物界面。如下圖是設(shè)計(jì)出的引物示意圖，主要包括引物的位置信息,從圖中我們可以看到所設(shè)計(jì)的引物主要位于p53基因的3'端。
下圖是引物序列詳細(xì)信息，包括引物長(zhǎng)度，Tm值，互補(bǔ)堿基個(gè)數(shù)（代表引物自身能互補(bǔ)配對(duì)的堿基個(gè)數(shù)，通常引物的互補(bǔ)堿基數(shù)越少越好）。從下邊引物序列詳細(xì)信息的圖中我們可以看到，引物的特異性很好，不存在非特異擴(kuò)增（如果引物存在非特異性擴(kuò)增，我們會(huì)在每個(gè)引物后面看到非特異擴(kuò)增的基因和序列信息），接下來(lái)我們只需要根據(jù)自己的需求從pubmed設(shè)計(jì)出的引物中隨機(jī)挑選適合自己的引物序列進(jìn)行引物合成即可。
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