原創(chuàng) 李紀(jì)偉 上海生命基因
環(huán)狀RNA CircFndc3b通過(guò)FUS/VEGF-A軸調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟修復(fù)
發(fā)表單位：坦普爾大學(xué)Lewis Katz醫(yī)學(xué)院
師弟：最近的circRNA研究好熱門(mén)！我看到好幾篇circRNA相關(guān)的文章都發(fā)表在高分雜志上，也好想試試circRNA機(jī)制分析。師兄，聽(tīng)說(shuō)你很精通circRNA分析，你能介紹一下circRNA文章的高分秘籍嗎？
師兄：好啊。我這里剛好有一篇10+分的circRNA機(jī)制的文章，我們一起看一看作者是如何做的吧。
摘 要
環(huán)狀RNA是由許多蛋白質(zhì)編碼基因產(chǎn)生的，但是它們?cè)谛难芙】岛图膊顟B(tài)中的作用仍然未知。在這里，我們報(bào)告鑒定在心肌梗死后（MI）小鼠心臟中差異表達(dá)的circRNA轉(zhuǎn)錄物，其中包括circFndc3b，其在MI后心臟中明顯下調(diào)。在缺血性心肌病患者的心臟組織中，人circFndc3b直向同源物也顯著下調(diào)。circFndc3b在心臟內(nèi)皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)增加了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A的表達(dá)，并增強(qiáng)了它們的血管生成活性，并減少了心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。MI后circFndc3b過(guò)度表達(dá)減少心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)新血管形成并改善左心室功能。從機(jī)理上講，circFndc3b與融合在肉瘤中的RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)突出了circRNA在心臟修復(fù)中的生理作用，并表明circFndc3b表達(dá)的調(diào)節(jié)可能代表了MI后促進(jìn)心臟功能和重塑的潛在策略。
師兄：閱讀文獻(xiàn)時(shí)理清文章的分析流程十分重要，我簡(jiǎn)單整理了一下文章的邏輯脈絡(luò)，就能更清晰地理解文章的內(nèi)容。
師弟：謝謝師兄！
結(jié) 果
1 、小鼠心臟模型的CircRNA分析
師兄：作者對(duì)小鼠心臟進(jìn)行circRNA芯片分析，鑒定MI后的差異表達(dá)circRNA，其中circFndc3b的表達(dá)量顯著下調(diào)，而qPCR驗(yàn)證其mRNA不差異表達(dá)。并且人的同源物也在患者中具有相似的差異變化，表明circFndc3b與MI相關(guān)。
下圖是對(duì)照和心肌梗死心臟的CircRNA譜。處理組和對(duì)照組在不同時(shí)間與原始樣品的circRNA的表達(dá)量差異變化表現(xiàn)為從藍(lán)色增加到紅色。熱圖是差異分析中十分常見(jiàn)，運(yùn)用不同的顏色將基因表達(dá)量的差異直觀地展示出來(lái)。
師弟：文章中使用了circRNA芯片定量circRNA，其他文獻(xiàn)有時(shí)候還用到RNA-seq測(cè)序進(jìn)行定量分析，那么師兄，基因芯片和RNA-seq之間有什么區(qū)別呢？我們應(yīng)該如何選擇呢？
師兄：基因芯片和RNA-seq都可以用于circRNA的定量，只不過(guò)基因芯片只包含已經(jīng)鑒定的circRNA，而RNA-seq有時(shí)能鑒定出新的circRNA?，F(xiàn)在circRNA的研究才剛剛起步，有大量circRNA還未鑒定，同時(shí)如果是不常用的物種就缺少相關(guān)的circRNA信息，很難通過(guò)基因芯片定量，所以我還是建議通過(guò)RNA-seq的方法定量circRNA。這里使用的是小鼠模型進(jìn)行研究，所以可以使用基因芯片進(jìn)行定量。
師弟：那這里的同源物分析是什么？作者為什么要進(jìn)行同源物分析呢？
師兄：同源物就是共同祖先在不同物種遺傳的基因，他們的序列之間擁有一定的相似性，并且功能上的作用可能也相關(guān)。這里作者進(jìn)行同源物分析其實(shí)也是一種對(duì)差異表達(dá)的circRNA的篩選，在人的同源物也與心臟疾病相關(guān)說(shuō)明其更有可能發(fā)揮重要作用。
下圖是人和小鼠circFndc3b序列的成對(duì)比對(duì)結(jié)果，相似率達(dá)到86.5%。
2、 circFndc3b的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞功能并減少心肌細(xì)胞凋亡
師兄：確定了circFndc3b作為研究對(duì)象，首先就需要對(duì)circFndc3b的環(huán)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。作者通過(guò)Sanger測(cè)序、RNase R處理驗(yàn)證了circFndc3b在Fndc3b基因的外顯子2和3的反向連接。
師弟：嗯。鑒定circRNA的靶基因是研究circRNA的功能機(jī)制的關(guān)鍵一步，這篇文章是如何找到circFndc3b靶基因的呢？
師兄：本文是通過(guò)circFndc3b過(guò)表達(dá)后使用基因芯片分析差異基因，并通過(guò)qPCR篩選出circFndc3b可能的靶基因VEGF-A，根據(jù)VEGF-A已知的功能，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circFndc3b的功能?；蛐酒邪伺c血管生成相關(guān)的基因。也就是說(shuō)，通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)的基因表達(dá)量變化與相關(guān)的功能結(jié)合篩選circRNA的靶基因。
下圖是顯示血管生成基因芯片的對(duì)照和circFndc3b過(guò)表達(dá)的差異表達(dá)基因的熱圖。
3、 CircFndc3b過(guò)表達(dá)減輕LV功能障礙并增強(qiáng)新生血管形成減少纖維化
師兄：接下來(lái)，作者通過(guò)circFndc3b的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其在心臟和血管相關(guān)的作用。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circFndc3b改善了LV功能障礙，并促進(jìn)血管生成，減少梗死面積。
4、 circFndc3b發(fā)揮功能的途徑不是與miRNA結(jié)合，而是通過(guò)circFndc3b-FUS-VEGF-A信號(hào)網(wǎng)絡(luò)
師兄：這里為了研究circFndc3b是如何靶向靶基因VEGF-A，如何發(fā)揮功能的，作者首先驗(yàn)證了其作為miRNA海綿的作用。預(yù)測(cè)了circFndc3b與miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，并通過(guò)熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circFndc3b與3個(gè)miRNA有互作。將circFndc3b與靶標(biāo)miRNA結(jié)合位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)circFndc3b的功能沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明circFndc3b的主要功能可能不是與miRNA結(jié)合發(fā)揮的。
師弟：這里沒(méi)有驗(yàn)證出circFndc3b有miRNA海綿的功能，為什么還需要將這些結(jié)果發(fā)表出來(lái)呢？
師兄：miRNA海綿是常見(jiàn)的circRNA功能，從這里我們可以總結(jié)出一般circRNA的miRNA海綿功能的研究與驗(yàn)證過(guò)程。首先使用預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)與circRNA相互作用的miRNA，然后利用熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRNA與miRNA的相互作用，最后通過(guò)circRNA突變或者miRNA的敲低過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miRNA參與circRNA的功能。
師弟：我明白了！那circFndc3b發(fā)揮功能不是通過(guò)與miRNA結(jié)合，那會(huì)是通過(guò)什么機(jī)制呢？
師兄：除了充當(dāng)miRNA海綿外，circRNA還會(huì)通過(guò)與RNA結(jié)合蛋白相互作用而發(fā)揮功能。作者進(jìn)一步預(yù)測(cè)circFndc3b與RNA結(jié)合蛋白的互作，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了circFndc3b與FUS的結(jié)合，并且FUS的功能與circFndc3b的功能相關(guān)。通過(guò)circFndc3b和FUS的敲低過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)靶基因VEGF的表達(dá)變化，于是構(gòu)建了circFndc3b與FUS的互作調(diào)控VEGF表達(dá)的互作網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該通路在體內(nèi)也調(diào)控VEGF的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)梗死后的心臟修復(fù)。
師弟：那么研究circRNA與RNA結(jié)合蛋白互作有沒(méi)有什么套路呢？
師兄：RNA結(jié)合蛋白雖然種類(lèi)不多，但在轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。一些RNA結(jié)合蛋白（RBP）可以與circRNA結(jié)合，造成circRNA及其同源mRNA之間的競(jìng)爭(zhēng)，從而影響翻譯。一般我們可以利用pull-down實(shí)驗(yàn)和RNA免疫共沉淀（RIP）驗(yàn)證RNA分子與蛋白的互作。
討 論
師弟：謝謝師兄為我介紹了這么多！你對(duì)現(xiàn)在circRNA分析怎么看？
師兄：circRNA在疾病的基因調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，現(xiàn)在還有許多circRNA沒(méi)有鑒定，很多circRNA的功能也不了解，所以現(xiàn)階段是circRNA發(fā)高分文章較容易的時(shí)期。以本篇文章為例，作者揭示了circFndc3b的外源傳遞在減輕MI后小鼠左心室功能障礙中起重要作用，并驗(yàn)證了其通過(guò)FUS / VEGF信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制表現(xiàn)出心臟保護(hù)作用。下圖為circFndc3b介導(dǎo)的心臟修復(fù)機(jī)制。
材料方法
環(huán)形RNA芯片
對(duì)分別從MI和對(duì)照小鼠心臟（n＝2）提取的總RNA進(jìn)行CircRNA表達(dá)分析。原始表達(dá)強(qiáng)度被log2轉(zhuǎn)化并通過(guò)分位數(shù)歸一化。差異表達(dá)閾值為p≤0.05和| FC |≥2.0。
資料可用性
基因表達(dá)綜合（GEO）提供了支持這項(xiàng)研究結(jié)果的芯片數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為GSE133503。
師兄：這篇文章主要內(nèi)容都是圍繞研究circFndc3b的功能機(jī)制展開(kāi)的，所需要的實(shí)驗(yàn)主要包括處理組和對(duì)照的基因芯片、敲低和過(guò)表達(dá)等功能實(shí)驗(yàn)以及生物大分子互作篩選等機(jī)制驗(yàn)證，是值得學(xué)習(xí)的circRNA機(jī)制文章。你所問(wèn)的高分秘籍就在于circRNA機(jī)制的一般研究方法，比如驗(yàn)證與circRNA互作的分子、篩選受circRNA調(diào)控的下游基因和通路、構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)等等，環(huán)環(huán)相扣，邏輯嚴(yán)密，發(fā)一篇高分文章并不是什么困難的事！
師弟：師兄，聽(tīng)了你的講解，我終于把這篇文章理解了。你怎么會(huì)知道的這么多??？
師兄：師弟，這就需要平時(shí)多看文獻(xiàn)多做總結(jié)了。我向你推薦一個(gè)超好用的公眾號(hào)：上海生因生物。這個(gè)公眾號(hào)定期發(fā)布關(guān)于circRNA和RNA-seq相關(guān)的文獻(xiàn)解讀和干貨視頻，還提供免費(fèi)的分析服務(wù)。
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